Gostaríamos de agradecer a Monika Tarnowska, Cornelia Albrecht, e Ewa Skoczylas pela excelente assistência técnica. Este estudo foi financiado pela SNF Sinergia concessão CRSI33-125073 para PP.

<ol>
	<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat. Rev. Genetics. 6, 507-512 (2005).</li><li>Johansson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+zoo+of+mice+for+genetic+analyses:+a+comprehensive+protocol+for+the+rapid+generation+of+BAC+transgenic+mice.">Building a zoo of mice for genetic analyses: a comprehensive protocol for the rapid generation of BAC transgenic mice.</a> Genesis. 48, 264-280 (2010).</li><li>Skarnes, W. 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L., Schmidt, T., Kaiser, V., Honing, K., Hornung, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ligation-independent+cloning+technique+for+high-throughput+assembly+of+transcription+activator-like+effector+genes.">A ligation-independent cloning technique for high-throughput assembly of transcription activator-like effector genes.</a> Nat. Biotechnol. 31, 76-81 (2013).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases.">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+off-target+mutagenesis+induced+by+CRISPR-Cas+nucleases+in+human+cells.">High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.</a> Nat. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases.">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li><li>Doyon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+zinc-finger-nuclease+activity+with+improved+obligate+heterodimeric+architectures.">Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures.</a> Nat. 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T., Gersbach, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+ten+inbred+mouse+strains+following+assisted+reproductive+technologies+(ARTs).">Performance of ten inbred mouse strains following assisted reproductive technologies (ARTs).</a> Theriogenology. 65, 1716-1726 (2006).</li><li>Luo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superovulation+strategies+for+6+commonly+used+mouse+strains.">Superovulation strategies for 6 commonly used mouse strains.</a> J. Am. Assoc. Lab. Animal Sci. 50, 471-478 (2011).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> International Society for Transgenic Technologies. 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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Orientada por nuclease Designer genoma abordagens edição estenderam significativamente a gama de espécies passíveis de alterações específicas dos respectivos genomas 10,12. Em ratinhos, em células ES de direccionamento de genes tem sido uma técnica padrão para mais de duas décadas; no entanto, tem sido difícil para se adaptar às células-tronco embrionárias de outros do que o mouse espécies, embora tenha havido algum sucesso recente em ratos células-tronco embrionárias. Mesmo com a disponibilidade de &quot;off-the-shelf&quot; rato ES clones de células alvo de genes fornecidos por consórcios como EUCOMM, KOMP ou NorCOMM 3 genoma edição por ZFN e TALEN proporciona maior precisão e flexibilidade em relação ao espectro de modificações que podem ser introduzida no genoma do rato. Animais fundadores portadores de mutações mediada por nuclease parece ser altamente germe linha competente 4-6,20,21, o que nem sempre é o caso para as quimeras provenientes injecções blastocisto de células ES. Assim, em certos casos, a microinjecção de desnucleases Igner pode resultar em geração significativamente mais rápido de novas linhas de mouse com modificações do genoma direcionados. A geração bem sucedida de camundongos knockout por injeção de ZFN e TALEN depende, em grande medida, da atividade do par nuclease injetado. TALENS tenham demonstrado ter uma elevada taxa de sucesso em atingir uma grande variedade de genes em vários organismos; No entanto, estudos recentes sugerem que a ligação é sensível ao TALEN metilação da citosina 30,31. Assim, os pares de nuclease recém-gerados, por exemplo TALENS clonado em vectores pCAG-T7, pode ser transfectada de forma transiente numa linha de células de rato tais como NIH-3T3 ou Neuro -2a, que imitam o estado da cromatina do embrião de rato, em certa medida. Aqui, a atividade nuclease pode ser estimada utilizando o ensaio endonuclease T7 ou uma restrição resumo de produto de PCR, como descrito na seção 5 antes da síntese de mRNA e microinjeção. Recomendamos seqüenciamento da região genômica de interesse no que diz respeitoive linha celular ea tensão do rato usado para experimentos de microinjeção. Em zigotos murinos, diferentes pares talen ou ZFN funcionará optimamente a diferentes concentrações de mRNA e, por conseguinte, a concentração de trabalho óptima do ARNm de nuclease microinjectado podem ter que ser determinadas experimentalmente. Dependendo do par de nuclease, uma concentração demasiado baixa irá resultar em nenhuma clivagem enquanto demasiado elevada pode resultar na letalidade de embrião. Dependendo do par de nuclease, tivemos sucesso utilizando as concentrações de mRNA total de tão baixas quanto 2 ng / mL e tão alta quanto 200 ug / ul. Estes efeitos são difíceis de prever a partir de experiências em cultura de células e a concentração óptima de nuclease para a sobrevivência do embrião e taxa de alteração do locus alvo precisa de ser determinada empiricamente. ZFN altamente ativa ou TALEN pode unir sua seqüência alvo além do estágio de uma célula do embrião microinjeção e, assim, causar padrões complexos de mutagênese umd mosaicismo em fundadores. Nós e os outros quatro têm observado três ou mais alelos mutantes distintos em um único fundador (Figura 5C). Assim, ao estabelecer uma nova linha de rato a partir desses fundadores, filhos devem ser cuidadosamente selecionados por sequenciamento para a presença da mutação favorável desde que os ensaios de digestão fornecem evidências de que apenas uma mutação indefinido está presente. Uma das críticas frequentemente manifestadas contra os sistemas de ZFN e talen é a possibilidade de que estas nucleases são também capazes de clivagem de sequências presentes em outro lugar no genoma, que são semelhantes aos sítios alvo. Tais efeitos fora do alvo têm sido observados com reagentes primeira geração usando o domínio homodimérico FokI e construções heterodímero foram projetados para aliviar os efeitos fora do alvo 25. Locais fora do alvo potencial podem ser previstos, em certa medida in silico 32,33 e rastreados por PCR e sequenciação. Uma vantagem óbvia of usando ZFNs TALENS e para a geração de ratinhos em vez de linhas de células é a possibilidade de remoção de fora mutações alvo não ligados a modificação do genoma desejado realizando retrocruzamentos a uma estirpe de tipo selvagem de escolha. Para a análise de um grande número de ratinhos progenitores, a próxima geração de profundidade sequenciação dos produtos de PCR gerados a partir do locus alvo de nuclease e in silico previsto fora do alvo loci pode oferecer uma leitura qualitativa e quantitativa alternativa aos ensaios de digestão dos produtos de PCR. As técnicas de reprodução assistida descritos neste protocolo são otimizados para cepas padrão de mouse usados ​​para experimentos de microinjeção, como C57Bl/6J ou B6D2F1. Ratos de diferentes origens, como cepas outbred, pode, em princípio, ser utilizada para abordagens edição do genoma e pode fornecer um fundo genético mais adequado para questões de pesquisa específicas. O desempenho de técnicas de reprodução assistida, como a superovulação pode ser predicted para um número de estirpes de 34-36, mas pode requerer mais de optimização para estirpes diferentes do padrão, a fim de se obter um número suficiente de embriões para nuclease microinjecção. Para além ZFN e TALEN, novas nucleases grife como o sistema CRISPR/Cas9 guiado RNA-9,37,38 foram agora introduzidas para aplicações de edição de genoma. Todos os métodos para a microinjecção e análise de animais fundadores aqui descritas são também aplicáveis ​​aos CRISPR/Cas9 e modos futuros de edição genoma.

Os ratos são, de longe, a plataforma mais popular para a geração de modelos de animais transgênicos. A caixa de ferramentas versáteis para a engenharia genética do embrião de rato 1-3 foi recentemente prorrogado por abordagens edição do genoma com base em nucleases designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFN) 4-6, transcrição nucleases efetoras ativador-like (Talen) 7,8, e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindrômicas curtas (CRISPR) / (Cas) 9-associados CRISPR sistema 9. ZFN e função TALEN como pares de dois domínios de design personalizado à base de proteína de ligação a DNA (arrays de proteínas dedo de zinco e repetem-variable di-resíduos (RVDS), respectivamente), que são todos acoplados ao endonuclease FokI 10-12. Por outro lado, a especificidade de clivagem de ADN mediada por Cas9 é fornecido pela transactivação RNAs CRISPR (crRNA e tracrRNA, que também podem ser combinadas numa única molécula de ARN quimérico guia de ARN denominado 11) que age em complexo com oProteína CRISPR. Talens com uma seqüência definida de RVDS podem ser rapidamente construído por pesquisadores individuais, com uma multiplicidade de estratégias de montagem para escolher 13-17. CRISPR/Cas9 promete ainda menor geração de trabalho intensivo de nucleases grife, no entanto, a especificidade da guia de RNA-DNA de ligação ainda não está completamente resolvido 18,19. Geração de ZFNs personalizados até agora tem sido limitado a laboratórios acadêmicos especializados e fornecedores comerciais, como Sangamo Biosciences eo serviço Sigma CompoZr. Em geral, o genoma edição com nucleases grife visa introduzir vertente quebras duplas (DSB) em loci genômico definido, que, posteriormente, atrair final não homóloga juntar (NHEJ) ou recombinação homóloga (HR) máquinas de reparo do DNA 10,12. Reparação NHEJ-mediada de um DSB muitas vezes resulta na introdução de inserções e deleções, em estreita proximidade ao local de reparação. Assim NHEJ reparação cum ser explorada para bater para fora a função de um gene-alvo através da introdução de uma mutação frame-turno dentro do genes codificadores de proteínas seqüência 4,7,9. Alternativamente, a adição ou substituição de informação genética definida podem ser conseguidos proporcionando um doador de ADN em conjunto com as nucleases de design. Um doador de ADN compreende sequências de ADN concebidas para o investigador flanqueadas por regiões de homologia com o locus alvo, servindo assim como um molde para a reparação de DSB por HR. Ambos os plasmídeos 5,6,20 e de fita simples oligonucleotídeos 8,9,21 têm sido utilizados com sucesso como doadores. Nem NHEJ-nor genoma edição mediada por AR exigir a introdução de um marcador seleccionável para o genoma do embrião de rato, o que faz com que essas estratégias particularmente bem adequado para a criação de pequenas alterações na sequência de nucleótidos, sem perturbar a arquitectura genética global. Neste protocolo, descrevemos todos os procedimentos essenciais para a edição de genoma naembrião de rato usando Talens. Estes incluem: 1) identificação de um site de destino TALEN 22, 2) construção de Talens por clonagem Golden Gate 13, 3) síntese in vitro de TALEN mRNA, 4) microinjeção de TALEN mRNA em oócitos de camundongos fertilizados, 5) procedimentos cirúrgicos para transferência de embriões e 6) a análise de mutagénese induzida por TALEN em animais fundadores. Nós nos concentramos em microinjeção TALEN mRNA e triagem dos fundadores para induzidas NHEJ inserções / exclusões. Para este fim, geraram construções talen bifuncionais que permitem tanto a expressão em células de mamíferos quando transfectado como plasmídeos e na síntese in vitro do ARNm TALEN para microinjecção em embriões de ratinho. Estas construções compreendem um backbone CONTO truncado 23 fundido a heterodimeric FokI domínios 24,25 para a edição genoma ideal em células de mamíferos. Este protocolo também pode ser adotado para microinjeção de outras nucleases grife ou por injeções combinadas de nucleases grifee construções doadores (projeto de doadores de DNA tem sido descrita em excelentes publicações técnicas por Wefers et al. 26,27). Declaração de ética Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos do Instituto Cantonal de Veterinária da Cantão de Zurique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="524">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">BsaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0535S or L</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Esp3I</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0451</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Spectinomycin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0692-1ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">X-Gal</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4252</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">IPTG</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Plasmid-Safe nuclease</td>
			<td style="width:111px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12143</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM1345</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NucAway Spin Columns</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM10070</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNaseZAP</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2020-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NorthernMax Formaldyde Load Dye</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM8552</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNA Millennium Markers</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">10x TBE buffer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B52</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T7 endonuclease</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">pGEM-T EasyVector System I</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3600</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S-7563</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">pregnant mare&#39;s serum gonadotrophin (PMSG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G4877</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M2 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7167</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M16 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7292</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Mineral oil, embryo tested</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">CentraVet</td>
			<td style="width:119px;">Ket 201</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">46995</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Equipment/Tools</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo holding capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo injection capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GD-1</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Capillary puller (for example Sutter P97)</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Microforge (for example Narishige MF-900)</td>
			<td style="width:111px;">Narishige&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Walton skin scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14077-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14041-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical probe</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">10140-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clip system (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12031-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clips (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12032-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dumont fine forceps 5</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria curvrd forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11370-31</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria fine forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11399-80</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dietrich bulldog clamp</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">18038-45</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:111px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">CD-1 mice</td>
			<td style="width:111px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse genome engineering using designer nucleases

Camundongos transgênicos portadores modificações específicas do local do genoma (ko, batida-in) são de vital importância para dissecar sistemas biológicos complexos, bem como para a modelagem de doenças humanas e testar estratégias terapêuticas. Os recentes avanços no uso de nucleases de designer, tais como nucleases dedo de zinco (ZFNs), ativador de transcrição-como nucleases efetoras (Talens), e os aglomerados se repete regularmente palindrômicas curtas intercaladas (CRISPR) / (CAS) associada à CRISPR 9 sistema para o local- engenharia genoma específico em aberto a possibilidade de realizar rápida modificação do genoma segmentado em praticamente qualquer espécie de laboratório, sem a necessidade de contar com caule embrionárias (ES) tecnologia celular. Uma edição experimento genoma tipicamente inicia-se com a identificação de locais alvo de nuclease designer dentro de um gene de interesse, seguido por construção de domínios de ligação de ADN personalizados para dirigir a actividade de nuclease para o locus genómico definido pelo investigador. Plasmídeos nuclease Designer são in vitro &lt;/ Em&gt; transcrito para gerar mRNA para microinjeção de oócitos fertilizados de camundongo. Aqui, nós fornecemos um protocolo para alcançar a modificação do genoma alvo de injeção direta de TALEN mRNA em oócitos fertilizados de camundongo.

Foram construídos plasmídeos de destino compatível com o conjunto de Ouro GateTALEN publicado por 13 Cermak et al. Que permitem a expressão de TALENS em células de mamíferos, bem como a síntese in vitro de ARNm a partir do promotor do fago T7 (Figura 1C). Estes plasmídeos carregam domínios FokI heterodiméricos (ELD ou KKR mutações) que foram mostrados para reduzir fora do alvo efeitos relativos ao homodímeros FokI e aumentar a atividade clivagem em relação a primeira geração FokI heterodímeros 25,29. As reacções de montagem Golden Gate # 1 e # 2 são geralmente muito eficiente e cada colónia branca, quando analisados ​​por PCR de colónias, mostra o padrão esperado para o número particular de RVDS clonados (Figuras 1B e 1D). A análise em gel de ARNm sintetizada in vitro (Figura 2) deverá revelar uma única banda distinguíveis com pouca ou nenhuma mancha para cada amostra analisada. Deve haver uma mudança clara de tamanho entre amostras L1/R1 e L2/R2, L3/R3, que indica poliadenilação sucesso. Animais fundadores podem ser rastreados para alelos mutantes induzidos por NHEJ genotipagem utilizando PCR seguido por digestão com endonuclease de T7 (Figura 3) ou de uma digestão de restrição com uma enzima que cliva a sequência de tipo selvagem na região espaçadora do par de nuclease (Figura 4). O ensaio de T7 endonuclease é aplicável a qualquer tipo de mutação, independentemente da sequência genómica específica dentro da região espaçadora do par nuclease injectado; no entanto, ele detecta apenas desemparelhamentos entre cadeias de ADN de produtos de PCR de heteroduplex. Assim, no caso raro que um fundador carrega dois alelos mutantes de forma idêntica, os produtos de PCR que não mostram qualquer padrão de digestão T7. Essa distinção é, no entanto, sempre possível quando um local específico de restrição está localizado no interior da região espaçadora da nuclease que irá ser eliminado por NHEJInduzida por inserções / eliminações (Figura 5). Aqui, as bandas não digeridos indicam a presença de mutações e a ausência de quaisquer produtos digeridos sugere fortemente um fundador transportando mutações em ambos os alelos do gene alvo (marcado com um asterisco na Figura 4b). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> Figura 1. Golden Gate clonagem de Talen RVDS em heterodiméricos vetores pCAG-T7-Destino. A) Assembléia de matrizes RVD em vetores PFUs. Aqui é mostrado um exemplo de um par TALEN com matrizes CONTO individuais com 15 e 17 RVDS RVDS, respectivamente (para arrays CONTO mais de 21 RVDS, são necessárias três PFUs-RVDS assembléias, não apresentado). As setas indicam primers para reações de PCR colônia PFUs específicas do B). Produtos de PCRamplificados a partir de assembléias PFUs corretas normalmente mostram uma banda correspondente ao comprimento total de todos os RVDS clonados (por exemplo, cerca de 1,1 kb para 10 RVDS) e uma &quot;escada&quot; de menores bandas menos proeminentes devido à natureza repetitiva de matrizes RVD. C) A montagem final de matrizes PFUs-RVD e um plasmídeo contendo a última repetição (PLR) em vetores de expressão heterodiméricos Talen com FokIELD e FokIKKR variantes, respectivamente. A espinha dorsal TALEN (anotada como N e C) assemelha-se a arquitectura publicada por Miller et al. CAG 23 A (CMV elemento potenciador precoce / beta-actina de frango), o promotor permite níveis elevados de expressão em células de mamífero transfectadas, ao passo que o promotor do fago T7 permite em a síntese in vitro de mRNA (usar Saci para linearização do vector a jusante do codão de paragem da nuclease). D) Colónia de PCR utilizando os iniciadores indicados por setas em C) permite a identificação de montado correctamente TALENS. -Lengt completaprodutos h PCR são menos proeminentes, enquanto o &quot;efeito escada&quot; representa um indicador robusto de montagem bem-sucedida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> Figura 2. . Controle de qualidade de nuclease de ARNm na síntese in vitro utilizando electroforese em gel de agarose mRNAs ZFN são mostradas como um exemplo (L, deixou ZFN; R, ZFN direita). Amostras L1/R1 mostrar mRNA antes de poliadenilação, amostras L2/R2 espetáculo polyadenylated mRNA e L3/R3 mostrar mRNA poliadenilado purificada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <img<html> alt = &quot;Figura 3&quot; fo: content-width = &quot;6 pol&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Figura 3. Exemplo de uma digestão com endonucleases de T7 utilizados para a identificação de animais fundadores portadores de mutações induzidas por nuclease do locus alvo. A) Um par TALEN foi projetado para unir dentro da região codificadora do gene da proteína prion rato (Prnp, TALEN seqüência alvo pode ser fornecido mediante solicitação). Um produto de PCR é gerado usando um iniciador para a frente (F) localizado 110 pb a montante e um iniciador inverso (R) de 250 pb a jusante do local de clivagem TALEN. B) O produto de PCR é, subsequentemente, sujeito a formação de heteroduplex e digestão com endonuclease de T7. C) mutagénese induzida por TALEN dentro da região genómica alvo de fundadores individuais é revelada pela presença de um produto de comprimento completo por PCR com os produtos da digestão de 250 e 110 pb.50930/50930fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver imagem ampliada. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> Figura 4. Exemplo de uma digestão de restrição dos produtos de PCR utilizados para a identificação de animais fundadores portadores de mutações induzidas por nuclease do locus alvo específicos. ZFN para o locus alvo rato Rosa26 29 um local de restrição Xbal dentro do intrão 1. Fundadores A) foram rastreados por PCR utilizando a genotipagem um iniciador para a frente (F), localizado a 500 bp a jusante e um iniciador inverso (R) de 250 pb a jusante do local de clivagem. B) A digestão dos produtos de PCR com Xba I revela padrões de digestão, indicando ratinhos com mutações bi-alélicos (marcados com asteriscos), mono alélicas mutações (bandas digeridas e não digeridas, por exemplo, animais 2)e camundongos em peso (digestão completa, por exemplo, animais 21). C) Seqüenciamento de camundongos com potenciais modificações bi-alélicas mostra até 3 (animais 24) distintas inserções / exclusões. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a imagem ampliada</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome do Primer </td><td> Sequência de 5 &#39;para 3&#39; </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Seqüências de primers utilizados para a PCR de colônia e sequenciamento dentro do conjunto Golden Gate TALENprotocolo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Plasmídeo / Colecção </td><td> Contribuinte </td><td> Addgene ID </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0 </td><td> Voytas laboratório </td><td> 1000000024 </td><td> Contém todos os plasmídeos necessários para a montagem Golden Gate TALEN </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD vetores destino </td><td> Pelczar laboratório </td><td> 40131, 40132 </td><td> Add-on plasmídeos para a expressão em células de mamíferos TALEN e na síntese de ARNm in vitro </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Plasmídeos e coleções de plasmídeos necessários para a montagem Golden Gate TALEN podem ser obtidas Addgene ( <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> On-lineRecurso </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> Projeto de TALEN; TALEN previsão off-alvo </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> Projeto de TALEN, ABERTO ZFN, CoDA ZFN, CRISPR/Cas9 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> Projeto de TALEN, CRISPR/Cas9; CRISPR/Cas9 previsão off-alvo </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> Assembleia da TALEN seqüências para confirmação de resultados de sequenciamento </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> Projeto de montagem modular ZFN </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> Projeto de montagem modular ZFN </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Recursos on-line para a concepção de ZFN, TALEN e CRISPR/Cas9. </strong&gt;

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Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas.

Rato Genoma Engenharia Usando Nucleases Designer

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

mouse-genome-engineering-using-designer-nucleases

Research

JoVE Journal

Biology

28.5K visualizações.  University of Zurich.  Nucleases designers, tais como as nucleases de dedos de zinco (ZFNs) e activadores de transcrição, tal como nucleases efectoras (TALENS) pode ser utilizado para modificar o genoma de embriões préimplantação de ratinho por desencadear tanto a extremidade não homóloga de união (NHEJ) e recombinação homóloga (HR) vias. Estes avanços permitir a rápida geração de ratinhos com modificações genéticas precisas. 