Este protocolo permite manipular proteínas, ou expressão microRNA, em adipócitos diferenciados para estudar seu papel na função adipócitos. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos em adipócitos de rato 3T3-L1. Este método também pode ser aplicado a preadipócitos humanos diferenciados em adipócitos.
Demonstrando o procedimento estará Melanie Gaudfrin, técnica do nosso laboratório. Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 milímetros em DMEM sem piruvato, glicose de 25 milialares, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina. Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecido a 37 graus Celsius e 7% de dióxido de carbono.
Dois dias após a confluência, mude o meio de cultura, substituindo-o por DMEM sem piruvato, 25 milimolas de glicose, 10% FCS, e um por cento de penicilina e estreptomicina suplementada com 0,25 milimólar IBMX, 0,25 micromolar dexametasona, cinco microgramas por insulina mililitro e 10 micromolar rosmoiona. Incubar os pratos por dois dias. Dois dias depois, substitua o meio de cultura por DMEM sem piruvato, 25 milimomalares de glicose, 10% FCS e um por cento de penicilina e estreptomicina suplementada com cinco microgramas por insulina mililitro e 10 rosiglitazone micromolar e incubar por mais dois dias.
Alimente as células a cada dois dias com DMEM sem piruvato, 25 milimães de glicose, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina e mantenha as células na incubadora. Um dia ou algumas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 microgramas por mililitro em 30% de etanol a partir de uma solução de estoque a um miligrama por mililitro. Adicione 250 microliters de colágeno por poço de uma placa de 12 poços ou 125 microliters por poço de uma placa de 24 poços e espalhe a solução sobre a superfície do poço.
Deixe a placa sem a tampa sob o capô da cultura até que o colágeno seque. Em seguida, lave-o duas vezes com D-PBS. Pipeta o siRNA com meio essencial mínimo melhorado para misturar e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente.
Adicione o reagente de transfecção e o meio essencial mínimo melhorado ao siRNA e pipeta para misturar. Incuba-o por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.
Lave as células na placa de Petri de 100 milímetros duas vezes com D-PBS. Adicione 5x trypsin às células, certificando-se de cobrir toda a superfície com a trippsina. Aguarde 30 segundos e remova cuidadosamente a trippsina.
Incubar a placa de Petri por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius na incubadora. Em seguida, toque no prato para desprender as células, evitando danos celulares. Adicione 10 mililitros de DMEM sem piruvato, 25 milimões de glicose, 10% FCS e um por cento de penicilina e estreptomicina para neutralizar a trippsina.
Pipete cuidadosamente o meio para cima e para baixo para desacopr as células e homogeneizar a suspensão celular. Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador celular automatizado e ajuste a concentração das células para 0,625 milhões de células por mililitro de médio. Sementes 800 microliters da suspensão celular por poço de uma placa de 12 poços ou 400 microliters da suspensão celular por poço de uma placa de 24 poços contendo a mistura de transfecção.
Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular e não perturbá-las por 24 horas. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o supernaente por DMEM fresco sem piruvato, glicose de 25 milialares, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina e devolva as células à incubadora. Os pontos de tempo típicos para detectar knockdown de destino após a entrega de siRNA ou miR são de 24 a 48 horas para mRNA e de 48 a 96 horas para proteína.
Experimentos funcionais podem ser realizados em adipócitos transfectados, incluindo sinalização de insulina, captação de glicose, secreção de adipokine, lipólise e lipogênese. Os adipócitos foram mostrados para preservar sua morfologia após a transfecção. Dois dias após a transfecção, os adipócitos apresentaram gotículas lipídicas multiloculares com teor lipíduo não diferente entre os adipócitos transfectados e não transfectados.
A expressão mRNA de vários marcadores de diferenciação foi inalterada em células transfeinadas em comparação com a dos adipócitos não transfectados. O protocolo de transfecção reversa é eficiente, pois mais de 70% dos adipócitos foram transfeccionados. Três dias após a transfecção com siRNA contra Perilipin-1, o nível de mRNA de Perilipin-1 diminuiu em 70% e o nível de proteína em 63% a expressão perilipin-1 também foi analisada por microscopia de fluorescência quatro dias após a transfecção e foi constatado que diminuiu em 92% em comparação com sua expressão no controle de adipócitos.
A transfecção reversa de adipócitos com microRNA imitando oligonucleotídeos para aumentar a expressão do miR-34a é mostrada aqui. A superexpressão do miR-34a levou à diminuição da expressão proteica VAMP2 em 50%O knockdown de Perilipin-1 em adipócitos 3T3-L1 levou a um aumento na lipólise basal, enquanto a expressão excessiva do miR-34a levou à inibição da proteína induzida pela insulina quinase B e absorção de glicose. É importante alcançar um alto nível de diferenciação de adipócitos para realizar a transfecção em adipócitos recém-diferenciados e monitorar cuidadosamente o tratamento de adipócitos com trippsina.
Após a transfecção, é possível realizar experimentos funcionais nos adipócitos para estudar o impacto de proteínas ou manipulação de microRNA na sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise.
