Name: in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Stanford University School of Medicine. NOTA: Os animais estão sob anestesia com 3% de isoflurano vaporizador e fornecimento 3% de O2 gás. O uso de pomada veterinário nos olhos pode ajudar a prevenir o ressecamento enquanto sob anestesia. 1. Preparação de células <ol><li> Crescer endoteliais e células pericyte culturas humanas em placas de 100 mm com 10 ml de a mídia apropriada. Substituir 10 ml de meio fresco a cada 2 - 3 dias até que as células atingir 80% de confluência. <ol><li> Cultura de células endoteliais (ECs) em meio completo de células endoteliais (ECM) suplementado com empresa fornecido 5% de soro fetal de bovino (FBS), 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento celular endotelial 10%. </li><li> pericitos cultura em meios pericyte completo (PM) suplementado com empresa forneceu 2% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina e suplemento de crescimento pericyte 10%. </li&gt; </ol></li><li> Preparar misturas de células <ol><li> Calcula-se a quantidade necessária de células para os grupos experimentais e de controlo. NOTA: Cada plug no grupo experimental contém um milhão (1 x 10 6) ECs humana e duzentos mil (2 x 10 5) pericitos. Para o grupo controle, cada vela contém apenas 1,2 milhão de ECs humanos. O grupo de controlo negativo tem gel matriz única. Cada grupo deve incluir, pelo menos, quatro tomadas de corrente, o que exigiria dois ratos como tampões podem ser injectadas em cada lado de um rato parte inferior das costas. Três tampões serviria como triplicado para a experiência e o quarto pode ser utilizado no caso de uma falha. Preparar 25% de células adicionais para coincidir com o volume adicional de gel. </li><li> Recolher e contar as células de placas de cultura. <ol><li> Para retirar as células, remova a mídia e lavar uma vez com fosfato de 1x temperatura ambiente salino (PBS). Remover PBS, adicionar 1 ml de 0,25% EDTA de tripsina / 2,21 mM, e incubar durante 1 min. Lave as células fora da placa por adição de 2ml de meio e recolher num tubo de 15 ml. </li><li> A contagem de células utilizando um hemocitómetro de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Centrifuga-se o número adequado de células numa pelete a 400 xg durante 5 min. Para o grupo experimental, de centrifugação tanto ECs e pericitos para baixo junto em um pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Preparação matriz de gel <ol><li> Descongelar completamente na matriz de gel a 4 ° C durante 4 horas ou durante a noite para se obter uma solução homogénea. Não é necessária mistura. </li><li> aliquota gel de matriz em tubos de 1,5 ml e armazenar a 4 ° C. </li><li> Pré-frio estéreis tubos de 1,5 ml e 28 g seringas de 1 cc de insulina, a 4 ° C. Cuidado: Mantenha gel matriz no gelo em todos os momentos. </li><li> Misturar na matriz de gel frio com bFGF a uma proporção em volume de 1: 100 (concentração final de bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF solução estoque = 50 ug / ml) após reconstituição solução de gel matriz por pipetagem para cima e para baixo várias vezes, incubar em gelo por 30 - 60 min bntes de mistura com as células no passo 3.1. NOTA: Descongelar o estoque bFGF antes da mistura. Calcular o número de fichas necessárias para a injecção. Por exemplo, cada plug requer 200 gel matriz ul. Por conseguinte, preparar 25% de gel adicional. </li></ol> 3. Misturar matriz de gel com células <ol><li> Para cada grupo, ressuspender o sedimento de células (número de células contendo o caso) com o volume calculado de gel de matriz contendo bFGF. Misture com cuidado para evitar a formação de espuma e deixe no tubo de 15 ml em gelo até ratos são preparadas para injecção. </li></ol> 4. Rato Preparação <ol><li> 1 Anestesiar ratos SCID durante 5 minutos em 3% de isoflurano mais de O 2 a 3% em uma câmara de indução. Concentre-se em um grupo experimental, ratos ou 2, de cada vez. </li><li> Remover o rato da câmara de indução, lugar em um lado ventral almofada de aquecimento para baixo e rapidamente anexar um bocal focinho até o rosto do rato através de um sistema não-reinalação para fornecer anestesia em todo o injeprocedimento cção. Comutar o fluxo de gás a partir da câmara de indução para o sistema de reciclagem do ar e não diminuir a pressão do gás de 1,5% de isoflurano e 1,5% de O 2. </li><li> Remover pêlos de ambas as regiões traseiras laterais (cerca de 1 cm de diâmetro) com um creme da remoção da máquina de barbear ou cabelo. </li><li> Limpar a área da pele com uma compressa de álcool de 70%. </li><li> Devolver o mouse para a câmara de indução e repita os passos 4,2-4,4 com o segundo mouse. </li></ol> 5. Injecção matriz de gel <ol><li> Prepare um rato para injecção, anexando ao sistema não-reinalação e colocando no lado da almofada de aquecimento ventral para baixo. </li><li> Carregar o gel matriz para uma pré-arrefecida de 28 g de 1 cc de insulina seringa um rato de cada vez. <ol><li> Carregar o volume de 500 ul de gel de matriz completa em dois tampões (200 ul por encaixe e ainda 25% adicionais) para dentro da seringa. </li><li> Certifique-se para injectar o gel matriz para os ratos dentro de 3 min de carregar as células para dentro da seringa para impedir o cells se deposite no lado da seringa e para impedir a matriz de gel solidifique no interior da seringa. </li></ol></li><li> Levantar a pele volta para localizar espaço subcutâneo, em seguida, injectar 200 ul de gel matriz lentamente e uniformemente no espaço subcutâneo do posterior para trás da caixa torácica. </li><li> Remover a agulha de injecção lentamente, tendo o cuidado de evitar a matriz de gel de vazar para fora do local de injecção. Uma colisão vai formar no local da injecção. Limpe local da injecção com uma compressa embebida em álcool. </li><li> Repita os passos de injecção 5,2-5,5 no outro lado da parte traseira do rato, em seguida, deixar o mouse sobre as suas costas para 1 min para permitir a gelificação do gel matriz sobre a almofada de calor. </li><li> Delinear as duas colisões usando um marcador permanente para identificar a colisão após 14 dias. Depois de algum cabelo volta a crescer, será mais fácil encontrar a colisão. </li></ol> 6. Matrix Gel plug Isolamento: 14 dias após a injecção <ol><li> Eutanásia com humanidade os ratos por exposição do animals a&gt; 5 min de inalação de dióxido de carbono, seguido por deslocamento cervical para assegurar a morte. </li><li> Retire o bujão de gel matriz das costas do mouse. <ol><li> Remova cuidadosamente o cabelo de novo cultivadas em torno do local da injecção onde a ficha está localizado repetindo o passo 4.3. A linha de marcação indica o tamanho da colisão original sob a pele. </li><li> Excisar o encaixe juntamente com a pele e os músculos que rodeiam as camadas unidas nos lados superior e inferior do tampão, respectivamente. <ol><li> Usando finas tesouras cirúrgicas, fazer uma incisão na fronteira acentuada do tampão que é perpendicular à pele e cortar ao músculo debaixo do bujão. Em seguida, cuidadosamente cortada em torno da periferia do tampão ao longo da fronteira marcada. </li><li> Retirar a ficha, mantendo-ensanduichada entre as camadas de pele e músculo. lave imediatamente em um pequeno copo com 1x PBS para lavar o excesso de sangue. A ficha está agora pronto para ser fixado (passo seguinte, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Corrigir os plug em 4% de paraformaldeído. <ol><li> Colocar todo o tampão, incluindo as camadas da pele e músculo, em um tubo de 50 ml com 25 ml de 4% de paraformaldeído durante 24 horas à temperatura ambiente sem agitação. No dia seguinte, transferir o plugue em 25 ml de etanol a 70% durante mais 24 horas antes da inclusão em parafina. NOTA: Punho paraformaldeído com cautela. Use luvas. </li></ol></li></ol> 7. Parafina Processo Matrix Gel plug <ol><li> Prepare o plug para inclusão em parafina. <ol><li> Orientar a ficha, como mostrado na Figura 1A; colocar a ficha numa cassete de tecido de modo que o lado da ficha é virada para cima e as duas camadas da pele e músculo são visíveis através da superfície do bloco de tecido que vai ser cortado em primeiro lugar durante o corte. </li></ol></li><li> Parafina incorporar a ficha de acordo com Parafina protocolos padrão 13. </li><li> Corte 8 - 10 mm de espessura fora do bloco de tecido e montar em lâminas de microscópio According a parafina seccionamento protocolos padrão 13. </li><li> Armazenar as lâminas em local seco e fresco à temperatura ambiente até que esteja pronto para a coloração. </li></ol> 8. Secções mancha com hematoxilina e eosina (H &amp; E) 13 <ol><li> De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte. </li><li> solução de pipeta 100 mL H &amp; E para a seção e incubar por 1-5 min, ou até que haja um claro contraste entre núcleos azuis e citoplasma rosa em uma célula como visto sob um microscópio de luz na posição vertical no aumento de 10x. Tenha cuidado para não deixar que qualquer solução H &amp; E tocar o objectivo. </li><li> solução de lavagem H &amp; E fora do slide, molhando o slide em um grande copo de água da torneira, em seguida, coloque o slide em um rack no copo e lave com água corrente durante 2 min. </li><li> Move para o passo 9.8 para montar os slides. </li></ol> 9. Stain outros slides para Capilares Humanos e pericitos <ol><li> De-paraffinize as secções de tecido por passagem das lâminas por meio de 100% de xileno, duas vezes, com 100% de etanol, 95% de etanol, 70% de etanol e, finalmente, 1 x PBS, cada um durante 5 min à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em 1x PBS até ao passo seguinte. </li><li> Ferva as seções de solução de recuperação antigênica. <ol><li> Em um copo de 2 L, preparar a solução de recuperação de antigénio de ebulição usando 1x tampão de citrato (pH 7,0) a 95 ° C num bloco de aquecimento. </li><li> Depois de ferver, coloque as lâminas em um rack de metal e mergulhe na solução de recuperação antigênica em ebulição durante 20 min. </li><li> Cuidadosamente remover o copo do bloco de aquecimento com as lâminas submersas e ainda permitir que a solução voltar lentamente à temperatura ambiente durante cerca de 30 min. </li><li> Colocar as lâminas em 1x PBS até o próximo passo. </li></ol></li><li> Bloquear as seções em tampão de bloqueio (1x PBS, 5% de soro de cabra, 00,3% de Triton X-100). <ol><li> Desenhar um círculo hidrófobo em torno das bordas de cada secção com uma caneta PAP. </li><li> Colocar as lâminas em uma bandeja de humidade com água destilada na parte inferior do tabuleiro. </li><li> Pipetar 100 ul de tampão de bloqueio para as secções assegurando-se todo o tecido é coberta por fluido (pode necessitar de mais de 100 uL). </li><li> Incubar secções com tampão de bloqueio durante 1 h. </li></ol></li><li> Incubar seções com anticorpo primário. <ol><li> Preparar uma solução com dois anticorpos primários para sondar cada secção para CD31 (ECS) e actina do músculo liso (pericitos) diluída em tampão de diluição (PBS 1x, 1% de BSA, 0,3% de Triton X-100). NOTA: Aqui, a concentração de anti-CD31 é de 1:50 e concentração actina anti-músculo liso é de 1: 300. </li><li> Incubam-se as secções durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários em uma bandeja de humidade contendo água destilada. </li></ol></li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST (PBS 1x + 0,1% TweEN20) durante 5 min cada lavagem. </li><li> Incubar seções com anticorpo secundário. <ol><li> Prepara-se uma solução com um anticorpo secundário anti-coelho de cabra conjugada com fluoróforo para reconhecer o anticorpo de coelho anti-CD31 diluído no tampão de diluição. <ol><li> NOTA: O anticorpo primário actina de músculo liso já é conjugado com um fluoróforo CY3, assim, não coloração do anticorpo secundário é necessária. coelho concentração de anticorpo secundário de cabra anti-é de 1: 250. </li></ol></li><li> Incubar as secções durante 1 hora com anticorpo secundário ul 100 na bandeja de umidade contendo água destilada. </li></ol></li><li> Lavam-se as lâminas três vezes em 1x PBST, durante 5 min cada lavagem. </li><li> Montar os slides. <ol><li> Pipetar 2 - 3 gotas (~ 40 - 60 L) de solução antifade montagem com coloração nuclear DAPI em cada secção. </li><li> Delicadamente, coloque um não. 1,5 tampa de deslizamento sobre as seções e solução de montagem, permitindo que o fluido para se espalhar sobre as seções e as bordasa lamela. Suavemente utilizar um dedo para pressionar para fora as bolhas de ar que podem ser localizados ao longo do percurso. </li><li> Deixe que as lâminas secar por pelo menos 1 hora antes de utilizar. </li></ol></li></ol> 10. Quantificar Capilar Densidade e Estrutura 14 <ol><li> Contar o número de capilares em H &amp; E secções coradas, expressa como # / mm 2. <ol><li> Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de luz na posição vertical sob 40X. NOTA: Os capilares são identificados como tubos cheios com células vermelhas do sangue. </li><li> Alternativamente, em vez de capilares contando manualmente, use imagem software de análise (por exemplo, Wimasis Análise de Imagem) para quantificar vários parâmetros de angiogênese, como o número de navio, comprimento médio navio e diâmetro, e pontos de ramificação. </li></ol></li><li> Analisar a estrutura capilar em seções de imunofluorescência corados. <ol><li> Adquirir fotos de quatro campos diferentes em um microscópio de fluorescência invertidacom cubo de filtro FITC e TxRed. <ol><li> Use um cubo FITC para a imagem ECs por excitação a 488 nm de comprimento de onda e usar um cubo TxRed de pericitos de imagem por excitação a 594 nm de comprimento de onda. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

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O ensaio de tampão de gel de matriz tem provado ser um método conveniente e poderoso para avaliar a regulação do gene na angiogénese, os compostos angiogénicos e anti-angiogénicos in vivo, e para complementar os testes in vitro. Aqui, descrevemos em detalhe um ensaio tampão de gel matriz novela de angiogênese humana que investiga a interação entre as células endoteliais e pericitos durante a formação de vasos. Existem alguns passos novos e críticos n...

A angiogénese é o processo pelo qual novos vasos sanguíneos são formados a partir de uma rede vascular pré-existente e 1 é o foco da pesquisa em curso em muitas áreas, desde o desenvolvimento normal da doença. Este processo dinâmico envolve a proliferação e migração de células endoteliais (ECS) e recrutamento de pericitos para a construção de um tubo vascular que é dirigida para o local que necessita de oxigénio e de nutrientes de entrega 2. Para estudar este processo requer um ensaio dinâmico igualmente, o mais importante que pode recapitular a natureza tridimensional de formação de tubos. Os ensaios in vitro de matrizes 3D foram desenvolvidos para atender a essa necessidade e têm funcionado bem para permitir que pesquisadores para definir os passos discretos no espaço e no tempo em que a angiogénese ocorre 3, 4, 5, 6. No entanto, estes modelos in vitro de matrizes 3D estão limitadas a estudar navios não-perfundidos umd, por conseguinte, não têm componentes críticos pertinentes para o processo de angiogese (por exemplo, circulando o crescimento e factores inibitórios, a tensão não natural / forças através do leito vascular) e falhar para simular o ambiente complexo presente no tecido vivo. Para resolver esta limitação, vários ensaios in vivo da angiogénese têm sido desenvolvidos 7, incluindo o ensaio de tampão de gel de matriz, que será o foco do nosso relatório 8, 9. O ensaio de matriz de tampão de gel é um ensaio in vivo de angiogénese bem estabelecido que atrai pesquisadores, pois proporciona uma plataforma robusta para testar os papéis dos diferentes células e substâncias na angiogênese. gel de matriz é uma membrana basal solução disponível comercialmente que é segregado pela linha celular de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma de rato que solidifica em um material semelhante a gel a 37 ° C. A matriz de gel pode ser misturado com as células e / ou substâncias, tais como factores de crescimento, e injected subcutaneamente no mouse. O anfitrião ECs vai invadir a ficha ao longo de 14 dias, formar uma rede vascular, e tornar-se perfusão com sangue do hospedeiro. Até à data, os ensaios camada de gel de matriz têm-se centrado exclusivamente no estudo do comportamento da célula endotelial durante a angiogénese, no entanto, com o melhor de nosso conhecimento nenhum esforço foi feito ainda para determinar se este ensaio pode ser utilizado células endoteliais para co-cultura e pericitos para estudar como estes dois tipos de células interagem durante a angiogênese. Especificamente, a compreensão da relação entre ECs e pericitos é valioso para o estudo de doenças em que a perda de vasos sanguíneos é patológico, incluindo isquemia microvascular e doença vascular periférica 10, 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo que introduz pericitos derivadas de humanos para a mistura de gel da matriz juntamente com ECs humano e factor de crescimento de fibroblastos (bFGF). Esta mistura pode então ser injectado por via subcutânea in o dorso de ratinhos SCID para permitir a formação de pericitos, revestidos, vasos híbridos totalmente funcionais. Nosso protocolo descreve como preparar tampões de gel matriz contendo ECs humanos com ou sem pericitos humanos, colocação em ratinhos SCID e como analisar os cortes histológicos para endpoints angiogênese críticos.

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>primary human pulmonary pericytes</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&amp;nbsp; Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>stock solution is 50 &amp;mu;g/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 &amp;mu;l and stored at -20 degrees</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screw top tubes, sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair hair removal cream</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra fine surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (paraformaldehyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Representante H &amp; E e imunofluorescência coloração das seções camada de gel de matriz são mostrados na Figura 2. Os pontos de CE apenas fichas de exibir alguns vasos que na maioria não são perfundidos com sangue (Figura 2 parte superior esquerda, setas pretas), enquanto fichas contendo tanto ECs e pericitos mostrar vários perfundido vasos com diâmetros maiores e cobertura pericyte completa, como evidenciado por coloração SMA positivo imed...

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K visualizações.  Stanford University.  Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz. 

Vídeo: In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicina

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Imunologia e Infecção

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Biologia do Desenvolvimento

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Neurociência

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Endotelial estratégica Assay formação de células do tubo: Comparando Matriz Extracelular e Fator de Crescimento Reduzido Matriz Extracelular

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengenharia Humanos Networks microvascular em camundongos imunodeficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Biologia

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Ensaios In Vitro para Avaliar Formação e Perturbação de Embarque de Barreira de Sangue-Cérebro

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Simplificando os estudos de angiogênese com um ensaio de tampão de gel de matriz modificada

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

Autor em destaque: Investigando a angiogênese e a permeabilidade dos vasos por meio de um ensaio de tampão de gel de matriz modificada

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Ensaio de plugue de gel de matriz in vivo modificado para estudos de angiogênese

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...