Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Etik Beyanı: Hayvan denekleri Prosedürleri Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. NOT: Hayvanlar% 3 buharlaştırıcı izofluran ve O 2 gazının% 3 kaynağı ile anestezi altında bulunmaktadır. gözleri veteriner merhem kullanılması anestezi altında iken kuruluğunu önlemeye yardımcı olabilir. 1. Hücre Hazırlanması <ol><li> Uygun ortam, 10 ml 100 mm plakalarında insan endotel ve perisit hücre kültürleri büyütün. hücreler kadar 3 gün% 80 confluency ulaşmak - her 2 taze ortam 10 ml değiştirin. <ol><li> şirketi ile desteklenmiş tam endotel hücre ortamı (ECM) Kültür endotel hücreleri (EC),% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 10 penisilin / streptomisin ve% 10 endotel hücre büyüme takviyesi verilir. </li><li> şirket ile desteklenmiş tam perisit medya (PM) Kültür perisitler% 2 FBS,% 10 penisilin / streptomisin ve% 10 perisit büyüme takviyesi verilir. </li&gt; </ol></li><li> Hücre karışımları hazırlayın <ol><li> deney ve kontrol grupları için hücrenin gerekli sayısını hesaplayın. NOT: Deney grubunda her fiş bir milyon (x 10 6 1) İnsan ECS ve iki yüz bin (2 x 10 5) perisitleri içerir. Kontrol grubu için, her fiş, 1.2 milyon insan ECS sadece içerir. Negatif kontrol grubu, matris jel imkanına sahiptir. Her bir grup, fişler bir fare alt sırt bölgesinin her iki tarafında enjekte edilebilir iki fare gerektirir en az dört fişler, içermelidir. Üç fişler deney için üç nüsha olarak hizmet edecek ve dördüncü durumda tek başarısız kullanılabilir. jel ekstra hacim maç için% 25 ekstra hücreleri hazırlayın. </li><li> Toplayın ve kültür plakalarından hücreleri saymak. <ol><li> hücreleri ayırmak için, ortamını çıkarın ve oda sıcaklığında 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez yıkanır. PBS kaldır 1 mi% 0.25 tripsin / 2.21 mM EDTA ekleyin ve 1 dakika boyunca inkübe edin. 2 ekleyerek plaka kapalı hücre yıkayınml&#39;lik ortam ve 15 ml bir tüp içinde toplanır. </li><li> üreticinin talimatlarına göre bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı. </li><li> 5 dakika boyunca 400 xg&#39;de bir pelet içine hücrelerin uygun sayıda santrifüj. Deney grubu, santrifüj EC ve aşağı birlikte tek pelet haline perisitler hem. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matris jel çözeltisi, <ol><li> 4 saat ya da homojen bir çözelti elde etmek için gece boyunca 4 ° C&#39;de tam matris jel çözülme. Hiçbir karıştırma gereklidir. </li><li> 4 ° C&#39;de kısım matrisi 1.5 ml tüpler jel saklayın. </li><li> Ön-soğutma, steril 1.5 ml tüpler 4 ° C&#39;de 28 G 1 cc insülin şırıngası. Dikkat: Her zaman buz üzerinde matris jel tutun. </li><li> 1 bir hacim oranında bFGF soğuk matris jel karıştırın: 100 (bFGF nihai konsantrasyon = 0.5 ug / ml bFGF stok çözeltisi = 50 ug / ml) birçok kez aşağı yukarı pipetleme matris jel çözeltisi karıştırıldıktan sonra buz üzerinde inkübe 60 dk b - 30efore adım 3.1 hücrelerle karıştırılması. NOT: karıştırmadan önce stok bFGF çözülme. Enjeksiyon için gerekli fişleri sayısını hesaplayın. Örneğin, her bir fiş 200 ul matris jel gerektirir. Bu nedenle,% 25 ekstra jel hazırlamak. </li></ol> Hücreleri 3. karıştırın Matrix Jel <ol><li> Her bir grup için, bFGF ihtiva eden matris jel hesaplanan hacmi (uygun hücre sayısı ihtiva eden) hücre pelletini. köpük önlemek ve farenin enjeksiyon için hazırlanmaktadır kadar buz üzerinde 15 ml tüp içinde bırakmak için yavaşça karıştırın. </li></ol> 4. Fare Hazırlama <ol><li> Indüksiyon odasında% 3 İsofluranın 5 dakika artı% 3 O 2 için 1 SCID fareler anestezi. Bir seferde tek deney grubunda, ya da 2 fareler üzerinde odaklanın. </li><li> aşağı bir ısıtma yastığı ventral tarafta, indüksiyon odasından yer fareyi çıkarın ve hızlı bir şekilde enjeksiyonundan boyunca anestezi sağlamak için olmayan bir geri soluma sistemi aracılığıyla farenin yüzüne burun ağzına takılırSeçim sürecinde. Olmayan geri soluma sistemine indüksiyon odasına gaz akışını açın ve% 1.5 İsofluranın ve% 1.5 O 2 gaz basıncını düşürmek. </li><li> Bir tıraş makinesi veya tüy dökücü krem ​​(1 cm çapında etrafında) her iki lateral arka bölgelerden saç kaldırmak. </li><li> % 70 alkol ped ile cilt alanını silin. </li><li> indüksiyon odasına fare dönün ve tekrarlayın 4.2 adımları - 4.4 saniye fare ile. </li></ol> 5. Matris Jel Enjeksiyon <ol><li> olmayan geri soluma sistemi takılarak aşağı ısıtma yastığı ventral tarafta koyarak enjeksiyon için bir fare hazırlayın. </li><li> Bir seferde bir ön-soğutulmuş 28 G 1 cc insülin şırınga bir fare içine matris jel yükleyin. <ol><li> şırınganın içine iki fişler (200 fiş başına ul artı% 25 ekstra) için matris jel tam 500 ul hacmi yükleyin. </li><li> Make ce önlemek için enjektöre hücrelerin yüklenmesi 3 dakika içinde farelere matris jel enjekte eminşırınganın tarafına yerleşme ve şırınga içinde katılaşan gelen matris jel önlemek için rf. </li></ol></li><li> Daha sonra, deri altı boşluk bulmak göğüs kafesinin arka posterior deri altı uzaya yavaş yavaş ve eşit matris jel 200 ul enjekte geri cilt kaldırın. </li><li> enjeksiyon yerinde dışarı sızmasını matris jel önlemek için dikkatli olmak, yavaş yavaş enjeksiyon iğnesi çıkarın. Bir yumru enjeksiyon bölgesinde oluşturacaktır. alkol ped ile enjeksiyon bölgesini silin. </li><li> 1 dk ısı pad üzerinde matris jel jelleşme izin için daha sonra sırtında fare bırakın, fare arka diğer tarafında 5,5 - tekrarlayın enjeksiyon 5.2 adımları. </li><li> 14 gün sonra yumru tanımlamak için kalıcı bir kalem kullanarak her iki darbelere özetleyin. bazı saç geri büyür sonra, yumru bulmak daha kolay olacaktır. </li></ol> 6. Matris Jel Tak İzolasyon: 14 Gün Enjeksiyon sonrası <ol><li> hayvan teşhir ederek insanca fareler Euthanizeölümünü sağlamak için servikal dislokasyon tarafından takip karbondioksit inhalasyon&gt; 5 dk. </li><li> Farenin arkasından matris jel fişini çıkartın. <ol><li> Yavaşça fiş adımı 4.3 tekrarlayarak bulunduğu enjeksiyon yeri çevresinde regrown tüylerden. işaret çizgisi cilt altında orijinal yumru boyutunu gösterir. </li><li> sırasıyla, fişin alt ve üst tarafta takılı çevreleyen deri ve kas tabakaları ile birlikte fişi tüketim. <ol><li> ince cerrahi makas kullanarak, deriye dik fişin belirgin sınırında bir kesi yapmak ve fiş altındaki kas kesti. Daha sonra, dikkatli bir şekilde belirgin bir sınır boyunca tıpanın dış yüzeyi etrafında kesilir. </li><li> cilt ve kas tabakaları arasına sıkıştırılan tutarak fişi çıkarın. Hemen aşırı kan yıkayacak 1x PBS ile küçük bir beher durulayın. fiş (sonraki adım, 6.3) şimdi sabit hazırdır. </li></ol></li></ol></li><li> PLU&#39;nun Fix% 4 paraformaldehid içinde örn. <ol><li> Sallanan olmaksızın oda sıcaklığında, 24 saat süreyle% 4&#39;lük paraformaldehit, 25 ml ile 50 ml tüp içinde, deri ve kas tabakaları da dahil olmak üzere, tüm fiş, koyun. Bir sonraki gün, parafine önce başka bir 24 saat süre ile,% 70 etanol, 25 ml prize aktarın. NOT: dikkatli paraformaldehid tutun. Eldiven giy. </li></ol></li></ol> 7. Parafin Süreci Matrix Jel Tak <ol><li> parafine için fişi hazırlayın. <ol><li> Şekil 1a&#39;da gösterilen fiş Orient; fişin yüzü yukarı bakacak ve hem cilt ve kas tabakaları kesit sırasında ilk olarak kesilecek doku blok yüzeyi boyunca görünür böylece doku kasetine fişi yerleştirin. </li></ol></li><li> Parafin standart parafin gömme protokollere 13 göre fişi gömün. </li><li> mikroskop Accor slaytlar üzerine doku bloğu 10 indirim mikron kalınlığında kesitler ve montaj - 8 CutStandart parafin kesit protokolleri 13 artırılabilir. </li><li> boyama için hazır olana kadar oda sıcaklığında serin ve kuru bir yerde slaytlar saklayın. </li></ol> Hematoksilen ve Eosin Leke (H &amp; E) ile 8. Leke Bölüm 13 <ol><li> iki kez% 100 ksilen üzerinde kaydığı geçirilerek doku bölümleri de-paraffinize,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve son olarak da 1 x PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri. Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar bırakın. </li><li> Pipet 100 ul H &amp; E bölümü üzerine çözüm ve 1 inkübe - 5 dakika, ya da 10X büyütmede dik bir ışık mikroskop altında bakıldığında bir hücrede mavi çekirdekleri ve pembe sitoplazma arasında belirgin bir kontrast kalmayıncaya kadar. Herhangi bir H &amp; E çözüm hedefi dokunmasına izin için dikkatli olun. </li><li> musluk suyu büyük bir beher slayt dunking ile slayt yıkayınız H &amp; E çözümü, daha sonra beher bir rafa slayt yerleştirin ve 2 dakika süreyle akan su ile yıkayın. </li><li> Moslaytlar monte 9,8 adıma ettik. </li></ol> İnsan kılcal ve perisitlere 9. Leke Diğer Slaytlar <ol><li> iki kez% 100 ksilen üzerinde kaydığı geçirilerek doku bölümleri de-paraffinize,% 100 etanol,% 95 etanol,% 70 etanol ve son olarak da 1 x PBS, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca her biri. Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar bırakın. </li><li> antijen alma çözeltide bölümleri kaynatın. <ol><li> 2 L&#39;lik bir beher içinde, bir ısıtma bloğu üzerinde 95 ° C de antijen geri çözelti 1x sitrat tamponu (pH 7.0) kaynar hazırlar. </li><li> kaynama sonra, bir metal raf slaytlar yerleştirin ve 20 dakika için kaynar antijen alımı çözelti içinde daldırın. </li><li> Dikkatle de daldırılmış slaytlar ısıtma bloğundan beher çıkarın ve çözelti yavaş yavaş 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dönmesi beklenmektedir. </li><li> Bir sonraki adıma kadar 1x PBS slaytlar yerleştirin. </li></ol></li><li> tampon engelleme bölümleri (1x PBS,% 5 Keçi Serum, 0 engelle.3% Triton X-100). <ol><li> Bir PAP kalemle her bölümün kenarlarında bir hidrofobik bir daire çizin. </li><li> tepsinin alt damıtılmış su olan bir nem tepsisine slaytlar yerleştirin. </li><li> Emin tüm doku yapım bölümleri üzerine Pipet 100 ul engelleme tampon sıvısı ile kaplıdır (100&#39;den fazla ul gerekebilir). </li><li> 1 saat süre ile blokaj tamponu ile bölümleri inkübe edin. </li></ol></li><li> primer antikor ile bölümleri inkübe edin. <ol><li> CD31 (EC) ve seyreltme tamponu içinde seyreltildi düz kas aktini (perisitler) için her bir bölümü (1 x PBS,% 1 BSA,% 0.3 Triton X-100), sonda için iki primer antikorlar ile bir çözelti hazırlayın. Not: Burada, bir anti-CD31 yoğunluğu 1:50 ve anti-düz kas aktini konsantrasyonu 1: 300. </li><li> gece boyunca damıtılmış su ihtiva eden bir nem tepsisine 100 ul primer antikorlar ile 4 ° C&#39;de bölümleri inkübe edin. </li></ol></li><li> 1x PBST (1x PBS +% 0.1 Twe içinde slaytlar üç kez yıkayın5 dakika, her yıkama için en20). </li><li> ikincil antikor ile bölümleri inkübe edin. <ol><li> seyreltme tamponu içinde seyreltilmiş anti-CD31 tavşan antikorunu tanıyan bir flüorofor konjuge keçi anti-tavşan ikincil antikoru ile bir çözelti hazırlayın. <ol><li> NOT: düz kas aktini primer antikor zaten CY3 fluorofor ile konjuge, bu nedenle herhangi bir ikincil antikor boyama gereklidir. 250: Keçi-anti-tavşan ikincil antikoru konsantrasyonu 1&#39;dir. </li></ol></li><li> damıtılmış su ihtiva eden nem tepsisine 100 ul sekonder antikor ile 1 saat boyunca bölümler inkübe edin. </li></ol></li><li> 5 dakika, her yıkama için 1x PBST slaytlar üç kez yıkayın. </li><li> slaytlar monte edin. <ol><li> Her bölümü üzerine DAPI nükleer boyanma ile antifade montaj çözümün - (60 ul ~ 40) - Pipet 2 3 damla. </li><li> Yavaşça bir yer yok. sıvı bölümleri yayılmış için izin bölümleri ve montaj çözümü üzerinde ve kenarlarında 1.5 kapak kaymaKapak kayma. Yavaşça bölümünün üzerine yerleştirilebilir hava kabarcıklarını dışarı basın bir parmağınızı kullanın. </li><li> slaytlar dokunmadan önce en az 1 saat kurumasını bekleyin. </li></ol></li></ol> 10. nicelik değerlendirmesini Kılcal Yoğunluk ve Yapı 14 <ol><li> H &amp; E boyanmış kesitlerde kılcal damarların sayısını, # / mm 2 olarak ifade edilir. <ol><li> 40X büyütme altında dik bir ışık mikroskobu dört farklı alanlarda fotoğrafları edinin. Not: Kapiler kırmızı kan hücreleri ile dolu borular olarak tanımlanır. </li><li> Seçenek olarak ise, yerine el sayım kılcalların, örneğin damar sayısı, ortalama damar uzunluğu ve çapı ve branş noktası gibi çeşitli anjiyojenez parametrelerini ölçmek için görüntü analizi yazılımı (ör Wimasis Görüntü Analizi) kullanın. </li></ol></li><li> immunofluorescent boyanan kesitler kılcal yapısını analiz eder. <ol><li> bir ters floresan mikroskop dört farklı alanlarda fotoğrafları EdinmeFITC ve TxRed filtre küpü ile. <ol><li> 488 nm dalga boyunda eksitasyon görüntü EC bir FITC küp kullanın ve 594 nm dalga boyunda eksitasyon görüntü perisitlere bir TxRed küp kullanın. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
span.s1 {letter-spacing: -0.1px}
			</style></li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+angiogenesis.">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li><li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li><li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells.">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li><li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+(SIKVAV)+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo.">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li><li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix.">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li><li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis.">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Wnt/planar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis.">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li><li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair.">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li><li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+vessels,+endothelial+cells,+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action.">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li><li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension.">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li><li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).</li><li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure.">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li></ol>

No competing financial interests enclosed.

Matris jel yatağından tahlili, angiogenesisin, in vivo olarak anjiyogenik ve anti-anjiyojenik bileşikler gen regülasyonu değerlendirmek ve in vitro testler tamamlamak için kullanışlı ve güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. Burada detaylı olarak damar oluşumu sırasında endotel hücrelerin ve perisitlerin arasındaki etkileşimi inceler insan anjiojenleri yeni bir matris jel yatağından tahlili tarif eder. Bu protokolde birkaç roman ve kritik adıml...

Anjiyogenez yeni kan damarları normal gelişim hastalığın kadar birçok alanda genelinde devam eden araştırma odağı önceden varolan damar ağı 1&#39;den oluşan ve bir olan süreçtir. Bu dinamik süreç çoğalmasını ve endotel hücreleri (EC) ve oksijen ve besin teslim 2 ihtiyacı sitede yöneliktir vasküler tüp oluşturmak için perisitlerin işe göç içerir. Bu işlem, aynı derecede dinamik bir tahlil, tüp oluşumu üç boyutlu yapısını özetlemek için en önemlisi bir gerektirir incelenmesi. In vitro 3D matris deneyleri bu ihtiyaca cevap vermek geliştirilmiştir ve araştırmacılar anjiyogenez yeri 3, 4, 5, 6 aldığı uzay ve zamanda ayrık adımları tanımlamak için izin de çalıştı. Bununla birlikte, bu in vitro olarak 3D matris modelleri perfüze olmayan damarları, bir eğitim sınırlıdırd nedenle anjiyogenez sürecine uygun kritik bileşenleri eksikliği (örneğin, damar yatak boyunca büyüme ve inhibitör faktörler, doğal olmayan gerginlik / kuvvetleri dolaşan) ve canlı dokuda mevcut karmaşık ortamında simüle etmek için başarısız. Bu sınırlama gidermek için, birçok in vivo anjiyogenez deneyleri raporumuzun 8, 9 odak noktası olacaktır matris jel fiş deneyi de dahil olmak üzere, 7 geliştirilmiştir. Matris jel fiş tahlil angiogeneziste farklı hücre ve maddelerin rolleri test etmek için sağlam bir platform sağlar olarak araştırmacılara hitap köklü in vivo anjiyogenez testtir. Matris jel 37 ° C &#39;de, bir jel-benzeri malzeme içine katılaşmaktadır Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), fare sarkoma hücre çizgisi tarafından salgılanan bir ticari olarak temin edilebilir bazal membran çözümdür. Matris jel, büyüme faktörleri ve enjeksiyonundan gibi hücreler ve / veya maddeler ile karıştırılabilirfare içine deri altından cted. ev sahibi EC, 14 gün boyunca fişi işgal vasküler ağ oluşturacak ve konağın kanla perfüze hale gelecektir. Bugüne kadar, matris jel fiş deneyleri bu deney için ortak kültür endotel hücreleri ve perisitleri kullanılabilir olup olmadığını belirlemek için hiçbir çaba henüz yapılmamıştır, bizim bildiğimiz kadarıyla, ancak, anjiyogenez sırasında endotel hücre davranış çalışma odaklanmış olması bu iki hücre tipleri anjiyogenez sırasında nasıl etkileşimde çalışmak için. Özellikle, EC ve perisitlere arasındaki ilişkiyi anlamak mikrovasküler iskemi ve periferik vasküler hastalık 10, 11, 12 de dahil olmak üzere kan damarı kaybı patolojik olan hastalıkların, eğitim için değerlidir. Burada, insan EC ve fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile birlikte matris jel karışımına insandan türetilmiş perisitler getiren bir protokol açıklar. Bu karışım daha sonra deri altına enjekte edilebilirn, SCID farelerinin sırtı tam olarak işlevsel, perisit kaplanmış, hibrid damarlarının oluşumunu sağlamak için. Bizim protokol ile veya SCID fareleri ve nasıl kritik anjiyogenez bitiş noktaları için histolojik bölümleri analiz etmek, insan perisitlere, yerleştirme olmadan ya insan ECS içeren matris jel fişlerini hazırlamak açıklamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="806">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">PBS (Phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">0.25% Trypsin/0.53mM EDTA</td>
			<td style="width:115px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-053-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Endothelial Cell Media (ECM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1001</td>
			<td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Pericyte Media (PM) kit</td>
			<td style="width:115px;">Sciencell</td>
			<td style="width:119px;">1201</td>
			<td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:405px;">primary human pulmonary pericytes</td>
			<td style="width:115px;">Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&#160; Cells used at passage 1-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td>
			<td style="width:115px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">100-18B</td>
			<td>stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">356237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">28G 1cc Insluin Syringe</td>
			<td style="width:115px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">329410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td>
			<td style="width:115px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">1.5mL microcentrifuge tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">15 mL screw top tubes, sterile</td>
			<td style="width:115px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">PAP pen</td>
			<td style="width:115px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">8899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">hemocytometer</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Nair hair removal cream</td>
			<td style="width:115px;">Walmart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">anti-human CD31 primary antibody</td>
			<td style="width:115px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-B4737</td>
			<td>working solution is 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>working solution is 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td>
			<td style="width:115px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A-11008</td>
			<td>working solution is 1:250</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Prolong Gold DAPI solution</td>
			<td style="width:115px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">8961S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">microscope slides</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48300-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">no. 1.5 cover slips</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">citrate buffer 10x</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">21545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">extra fine surgical scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:405px;">Formalin (paraformaldehyde)</td>
			<td style="width:115px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">245-685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Tissue cassettes</td>
			<td style="width:115px;">Simport</td>
			<td>M492-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">goat serum</td>
			<td style="width:115px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">X0907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Matris jel fiş bölümlerinin Temsilcisi H &amp; E ve immunofluorescent boyama sadece fişler çoğunlukla içeren fişler ise kanda (sol Şekil 2 top, siyah oklar) ile perfüze olmayan bazı damarları EC ve perisitler hem perfüze birkaç görüntüler gösterilecek EC, Şekil 2&#39;de Bölümler gösterilmektedir CD31-pozitif EC hemen bitişiğinde pozitif SMA boyama ile kanıtlandığı gibi büyük çaplı ve tam perisit kapsama kaplar. Bu sonuçla...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse at JoVE.com

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut.

Fare Matrix Jel Plug Test kullanma İnsan endotel-pericyte Etkileşim Vivo Çalışmasında

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

in-vivo-study-human-endothelial-pericyte-interaction-using-matrix-gel

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K Görüntüleme.  Stanford University.  Biz matris jel fiş anjiyogenez testinin bir varyasyon kullanarak fare insan endotel-pericyte etkileşimleri incelemek için bir protokol mevcut. 

Video: In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, branching, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane.  Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels within the assays often do not resemble vessels in vivo.  Based on earlier work by Nehls and Drenckhahn, we have optimized an in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts.  This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis and, importantly, the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. EC are coated onto cytodex microcarriers and embedded into a fibrin gel.  Fibroblasts are layered on top of the gel where they provide necessary soluble factors that promote EC sprouting from the surface of the beads.  After several days, numerous vessels are present that can easily be observed under phase-contrast and time-lapse microscopy. This video demonstrates the key steps in setting up these cultures.

This video demonstrates the protocol of an in vitro angiogenesis assay that recapitulates several stages of angiogenesis. Time-lapse images of sprouting, lumen formation, branching and anastomosis - key features of angiogenesis - are shown.

Anjiyogenez Çalışmaları için optimize edilmiş Fibrin Jel Boncuk Testi

Angiogenesis is a complex multi-step process, where, in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature.  These ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In vivo Görüntüleme ve Yumurtalık Kanseri Ortotopik Fare Modeli Tedavi Tedaviler

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs are distinguished by a polyhedral lattice of clathrin that coats the vesicle membrane and serves as a mechanical scaffold. Clathrin coats are assembled during vesicle formation from individual clathrin triskelia , the soluble form of clathrin composed of three heavy and three light chain subunits7,8. Because the triskelion does not have the ability to bind to the membrane directly, clathrin-binding adaptors are critical to link the forming clathrin lattice to the membrane through association with lipids and/or membrane proteins9. Adaptors also package transmembrane protein cargo, such as receptors, and can interact with each other and with other components of the CCV formation machinery9.
Over twenty clathrin adaptors have been described, several are involved in clathrin mediated endocytosis and others localize to the trans Golgi network or endosomes9. With the exception of HIP1R (yeast Sla2p), all known clathrin adaptors bind to the N-terminal -propeller domain of the clathrin heavy chain9. Clathrin adaptors are modular proteins consisting of folded domains connected by unstructured flexible linkers. Within these linker regions, short binding motifs mediate interactions with the clathrin N-terminal domain or other components of the vesicle formation machinery9. Two distinct clathrin-binding motifs have been defined: the clathrin-box and the W-box9. The consensus clathrin-box sequence was originally defined as L[L/I][D/E/N][L/F][D/E]10 but variants have been subsequently discovered11. The W-box conforms to the sequence PWxxW (where x is any residue).
Sla1p (Synthetic Lethal with Actin binding protein-1) was originally identified as an actin associated protein and is necessary for normal actin cytoskeleton structure and dynamics at endocytic sites in yeast cells12. Sla1p also binds the NPFxD endocytic sorting signal and is critical for endocytosis of cargo bearing the NPFxD signal13,14. More recently, Sla1p was demonstrated to bind clathrin through a motif similar to the clathrin box, LLDLQ, termed a variant clathrin-box (vCB), and to function as an endocytic clathrin adaptor15. In addition, Sla1p has become a widely used marker for the endocytic coat in live cell fluorescence microscopy studies16. Here we use Sla1p as a model to describe approaches for adaptor-clathrin interaction studies. We focus on live cell fluorescence microscopy, GST-pull down, and co-immunoprecipitation methods.

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

Clathrin-mediated endocytosis depends on adaptor proteins that coordinate cargo selection and clathrin coat assembly. Here we describe procedures to study adaptor-clathrin physical interaction and live cell imaging approaches using as a model the yeast endocytic adaptor protein Sla1p.

In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...