Name: in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

倫理文：動物を対象とする手順は、スタンフォード大学医学部での施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 注：動物は、3％の気化イソフルランおよびO 2ガスの3％の供給と麻酔下にあります。目に獣医軟膏の使用は、麻酔下ながら乾燥を防ぐのに役立つかもしれません。 1.細胞の調製<ol><li>適切なメディアの10ミリリットルと100ミリメートルプレートにヒト内皮および周皮細胞培養物を成長させます。細胞が80％コンフルエンスに達するまで3日間 - すべての2新鮮な培地10ミリリットルを交換してください。 <ol><li>会社を補充した完全な内皮細胞培地（ECM）における培養内皮細胞（EC）は、5％ウシ胎児血清（FBS）、10％ペニシリン/ストレプトマイシン及び10％の内皮細胞成長サプリメントを供給しました。 </li><li>会社を補った完全な周皮メディア（PM）における培養周皮細胞は、2％FBS、10％のペニシリン/ストレプトマイシン及び10％周皮細胞成長サプリメントを供給しました。 </li&gt; </ol></li><li>細胞混合物を準備します<ol><li>実験群と対照群のためのセルの必要数を計算します。 注：実験群内の各プラグは百万（1×10 6）が含まれ、人間ECおよび20万（2×10 5）周皮。対照群については、各プラグは120万人の電気部品のみが含まれています。陰性対照群は、マトリックスゲルのみを有しています。各グループには、プラグは、マウスの腰の両側に注入することができるように、2つのマウスを必要とするであろう、少なくとも4つのプラグを含める必要があります。三つのプラグは1に障害が発生した場合に使用することができ、実験と第四のための三連として役立つであろう。ゲルの余分なボリュームを一致させるために25％余分な細胞を準備します。 </li><li>収集し、培養プレートから細胞を数えます。 <ol><li>細胞を剥離するために、メディアを取り出し、室温の1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1回洗浄します。 PBSを削除し、1ミリリットル0.25％トリプシン/ 2.21 mMのEDTAを追加し、1分間インキュベートします。 2を追加することによって、プレートから細胞を洗浄mlの培地とを15mlチューブに収集します。 </li><li>製造者の指示に従って血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li> 5分間400×gでペレットに適切な数の細胞を遠心します。実験群、遠心分離機ECおよびダウン一緒に1ペレットへの周皮細胞の両方について。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.マトリックスゲルの準備<ol><li>均一な溶液を得るために4時間又は一晩4℃で完全にマトリックスゲルを解凍します。いいえ混合は必要ありません。 </li><li> 4°Cで1.5 mlチューブとストア内の一定分量マトリックスゲル。 </li><li>事前チル滅菌1.5ミリリットルチューブ、4℃で28 G 1ccのインスリン注射器。注意：常に氷上マトリックスゲルを保管してください。 </li><li> 1の体積比でbFGFで冷マトリックスゲルミックス：100（bFGFの最終濃度を0.5μg/ mlに=; bFGFのストック溶液=50μg/ mlの）ダウンを数回ピペッティングによりマトリックスゲル溶液を混合した後、氷上でインキュベート60分B - 30ステップ3.1での細胞と混合EFORE。 注：混合前に在庫のbFGFを解凍します。注射のために必要なプラグの数を計算します。例えば、各プラグは200μlのマトリックスゲルが必要です。したがって、25％の余分なゲルを準備します。 </li></ol>細胞3.ミックスマトリックスジェル<ol><li>グループごとに、bFGFを含有マトリックスゲルの計算量で（適切な細胞数を含む）を細胞ペレットを再懸濁します。発泡回避し、マウスは注射用に調製されるまで、氷上で15 mlのチューブに残すように穏やかに混合。 </li></ol> 4.マウスの準備<ol><li> 3％イソフルランプラス誘導室中の3％O 2で5分間1 SCIDマウスを麻酔。一度に、1つの実験群、または2匹のマウスに焦点を当てています。 </li><li>誘導チャンバーからマウスを外しダウン加熱パッド腹側の場所と迅速麟蹄全体に麻酔を供給するために、非再呼吸システムを介してマウスの顔に鼻ノズルを取り付けますction手順。非再呼吸系に導入室からのガスの流れを切り替えて、1.5％イソフルランおよび1.5％O 2ガスの圧力を低下させます。 </li><li>シェーバーや脱毛クリームで（直径1cm前後）両側後肢領域から髪を削除します。 </li><li> 70％のアルコールパッドで皮膚領域を拭いてください。 </li><li>誘導チャンバーにマウスを戻し、リピートは4.2手順 - 4.4を2番目のマウスで。 </li></ol> 5.マトリックスゲル注入<ol><li>非再呼吸システムに付着し、加熱パッド上腹側を下に置くことによって、注射用1マウスを準備します。 </li><li>一度に予備冷却し28 G 1 ccのインスリン注射器1のマウスにマトリックスゲルをロードします。 <ol><li>注射器に2つのプラグ（200プラグあたりμlのプラス25％余分な）のためのマトリックスゲルの完全な500μlのボリュームをロードします。 </li><li> CEを防止するために、シリンジ内に細胞をロードする3分以内にマウスにマトリックスゲルを注入することを確認します注射器の側に沈降し、注射器の内側に固化からマトリックスゲルを防ぐためにからLLS。 </li></ol></li><li>その後、胸郭の背面後部の皮下空間にゆっくりと均等にマトリックスゲルの200μLを注入し、皮下スペースを見つけるために背中の皮膚を持ち上げます。 </li><li>注射部位から漏れるマトリックスゲルを防ぐために注意しながら、ゆっくりと注射針を外します。バンプは、注射部位に形成されます。アルコールパッドで注射部位を拭きます。 </li><li>その後、熱パッド上にマトリックスゲルのゲル化を可能にするために1分間の背中の上でマウスを残して、マウスの背中の反対側に5.5 - を繰り返し注入が5.2を繰り返します。 </li><li> 14日後にバンプを識別するための恒久的なマーカーを使用して、両方のバンプの概要を説明します。いくつかの髪が戻って成長した後、バンプを見つけることが容易になります。 </li></ol> 6.マトリックスゲルプラグの単離：注射後14日<ol><li>動物を暴露することによって、人道的にマウスを安楽死させます死を確実にするために頸椎脱臼に続く二酸化炭素吸入&gt; 5分秒。 </li><li>マウスの背中からマトリックスゲルプラグを取り外します。 <ol><li>ゆっくりとプラグはステップ4.3を繰り返して配置されている注射部位の周りに再成長の髪を削除します。マーカーラインは、皮膚の下に、元のバンプの大きさを示しています。 </li><li>それぞれ、プラグの上側と下側に取り付け、周囲の皮膚と筋肉層と一緒にプラグを切り出します。 <ol><li>微細手術用はさみを使用して、皮膚に対して垂直であり、プラグの下の筋肉にカットスループラグのマークされた境界に切り込みを入れます。その後、慎重にマークされた境界線に沿ってプラグの周囲にカット。 </li><li>それは、皮膚と筋肉の層の間に挟ま保ち、プラグを取り外します。すぐに余分な血液を洗い流すために、1×PBSを入れた小さなビーカーにすすいでください。プラグは（次のステップ、6.3）修正する準備ができました。 </li></ol></li></ol></li><li> PLUを修正しました。4％パラホルムアルデヒドでグラム。 <ol><li>揺動せずに室温で24時間、4％パラホルムアルデヒド25mlで50mlチューブに、皮膚と筋肉の層を含む全体のプラグを置きます。次の日は、パラフィン包埋の前に別の24時間の70％エタノール25ミリリットルにプラグを移します。 注：慎重にパラホルムアルデヒドを処理します。手袋を着用してください。 </li></ol></li></ol> 7.パラフィンプロセスマトリックスゲルプラグ<ol><li>パラフィン包埋のためにプラグを準備します。 <ol><li> 図1aに示すように、プラグを方向付けます。プラグの側が上を向いているとの両方の皮膚や筋肉の層が切片の間に第1切断される組織ブロックの表面全体に表示されるように、組織カセットにプラグインを配置します。 </li></ol></li><li>パラフィンは、標準的なパラフィン包埋プロトコール13に従ってプラグを埋め込みます。 </li><li>顕微鏡は、アコーをスライド上に組織ブロックのオフに10μmの厚さの切片およびマウント - 8をカット標準的なパラフィン切片プロトコル13丁。 </li><li>染色のための準備ができるまで室温で涼しく乾燥した場所にスライドを保管してください。 </li></ol>ヘマトキシリンおよびエオシン染色（H＆E）13 8.ステインセクション<ol><li>二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。 </li><li>ピペットで100μlのH＆Eセクションへのソリューションと1のためのインキュベート - 5分、または10倍の倍率で直立光顕微鏡下で観察されるような細胞内の青色の核とピンクの細胞質の間に明確なコントラストがあるまで。任意のH＆Eソリューションは、目的を触れないように注意してください。 </li><li>水道水の大ビーカーでスライドを液体につけることによって、スライドのオフウォッシュH＆Eソリューションは、その後、ビーカー内のラックにスライドを配置し、2分間流水と面一に。 </li><li>モースライドをマウントする9.8ステップにVEの。 </li></ol> 9.ヒトキャピラリと周皮細胞染色する他のスライド<ol><li>二回、100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび最後に1×PBS 100％キシレンを介してスライドを通過させることによって、室温で5分間、各組織切片を脱パラフィンで処理します。次のステップになるまで1倍PBSでスライドを残します。 </li><li>抗原回復溶液中のセクションをゆでます。 <ol><li> 2Lのビーカーに、加熱ブロック上で95℃で1×クエン酸緩衝液（pH7.0）を使用して沸騰抗原回復溶液を調製します。 </li><li>沸騰したら、金属ラックにスライドを配置し、20分間沸騰抗原回復溶液中に浸します。 </li><li>慎重にまだ沈めスライドと加熱ブロックからビーカーを取り除き、溶液をゆっくり約30分間室温に戻すことができます。 </li><li>次のステップになるまで1倍PBSでスライドを置きます。 </li></ol></li><li>ブロッキング緩衝液中のセクション（1×PBS、5％ヤギ血清、0をブロック.3％のTriton X-100）。 <ol><li> PAPペンで各セクションのエッジの周りに疎水性の円を描きます。 </li><li>トレイの底に蒸留水で湿度トレイにスライドを配置します。 </li><li>必ずすべての組織を作るのセクションの上にピペットで100μlのブロッキングバッファーを流体によって覆われている（以上100μlのが必要な場合があります）。 </li><li> 1時間、ブロッキングバッファーを持つセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li>一次抗体を持つセクションをインキュベートします。 <ol><li>各CD31（ECS）のためのセクションおよび希釈緩衝液（1×PBS、1％BSA、0.3％トリトンX-100）で希釈した平滑筋アクチン（周皮細胞）を精査するために、2つの一次抗体で1溶液を調製します。 注記：ここでは、抗CD31濃度1:50であり、抗平滑筋アクチン濃度は1：300。 </li><li>蒸留水を含む湿度トレイに100μlの一次抗体と4℃で一晩のセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li> 1×PBST（1×PBS + 0.1％TWEでスライドを3回洗浄各5分洗浄用EN20）。 </li><li>二次抗体を持つセクションをインキュベートします。 <ol><li>希釈緩衝液中に希釈した抗CD31ウサギ抗体を認識し、フルオロフォアコンジュゲートヤギ抗ウサギ二次抗体を含む溶液を調製します。 <ol><li>注：平滑筋アクチン一次抗体は、すでにCY3フルオロフォアとコンジュゲートされているので、二次抗体染色は必要ありません。 250：ヤギ抗ウサギ二次抗体濃度は1です。 </li></ol></li><li>蒸留水を含む湿度トレイに100μlの二次抗体と1時間のセクションをインキュベートします。 </li></ol></li><li>各洗浄5分間、1×PBSTでスライドを3回洗浄します。 </li><li>スライドをマウントします。 <ol><li>各セクションへのDAPI核染色と退色防止マウントソリューションの - （60μL〜40） - ピペット2 3滴。 </li><li>優しくなしを配置し​​ます。 1.5カバーセクションの上にスリップし、マウントソリューション、流体はセクションに広がるすることを可能にするとの縁へカバースリップ。ゆっくりセクションの上に配置することができる気泡を押し出すために指を使用しています。 </li><li>スライドを取り扱う前に、少なくとも1時間乾燥させます。 </li></ol></li></ol> 10.定量化毛細血管密度と構造14 <ol><li> H＆E染色切片における毛細血管の数をカウントし、＃/ mm 2のように表します。 <ol><li> 40Xの倍率で直立光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を取得します。 注：キャピラリーは赤血球で満たされた管として識別されます。 </li><li>あるいは、代わりに手動で計数キャピラリーの使用画像解析ソフトウェア（ 例えば、Wimasis画像解析）は、血管数、平均血管長及び直径、および分岐点のような種々の血管形成のパラメータを定量化します。 </li></ol></li><li>免疫蛍光染色した切片に毛細管構造を分析します。 <ol><li>倒立蛍光顕微鏡上の4つの異なるフィールドの写真を買収FITCとTxRedフィルターキューブを持ちます。 <ol><li> 488 nmの波長で励起することにより、画像のECへのFITCキューブを使用し、594 nmの波長で励起することにより、画像の周皮細胞へのTxRedキューブを使用しています。 <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
			</style><style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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マトリックスゲルプラグアッセイは、血管形成、in vivoでの血管新生および抗血管新生化合物における遺伝子調節を評価するため、およびインビトロ試験を補完するために便利で強力な方法であることが証明されています。ここでは、詳細には血管形成中の内皮細胞と周皮細胞との間の相互作用を調べ、ヒト血管新生の新規マトリックスゲルプラグアッセイを記述する。 <p clas...

血管新生は、新しい血管が既存の血管ネットワーク1から形成されるプロセスであり、正常な発達、疾患の範囲の多くの地域を横切って進行中の研究の焦点です。この動的なプロセスは、酸素や栄養素デリバリー2を必要とするサイトに向けられている血管の管を構築するために、内皮細胞（EC）および周皮細胞の動員の増殖および移動を伴います。このプロセスを研究するためには、管形成の3次元性を再現することができます1、最も重要なのは、同じように動的分析を必要とします。 in vitroでの3Dマトリックスアッセイは、この必要性に対処するために開発されており、研究者は、血管新生が生じ3、4、5、6をとる空間および時間における個別のステップを定義することができるように十分に取り組んできました。しかし、これらのインビトロ 3Dマトリックスモデルは、非灌流血管研究に限られていますdは、したがって、血管新生プロセスに関連する重要なコンポーネントが不足している（ 例えば、血管床を横切って成長と阻害因子、不自然なテンション/力を循環させる）と、生きている組織に存在する複雑な環境をシミュレートすることができません。この制限に対処するために、いくつかのin vivoでの血管新生アッセイは、当社の報告書8、9の焦点になるマトリックスゲルプラグアッセイを含む、7を開発されてきました。 マトリックスゲルプラグアッセイは、血管新生に異なる細胞や物質の役割をテストするための堅牢なプラットフォームを提供するので、研究者にアピールする十分に確立されたin vivoでの血管新生アッセイです。マトリックスゲルは、37℃でゲル状物質に固化エンゲル-Holm-Swarm（EHS）マウス肉腫細胞株によって分泌される市販の基底膜溶液です。マトリックスゲルは、細胞および/またはそのような成長因子、および麟蹄などの物質と混合することができますマウスに皮下CTED。ホストのECは、14日間にわたってプラグに侵入血管網を形成し、宿主の血液で灌流になります。現在までに、マトリックスゲルプラグアッセイこのアッセイは、に共培養内皮細胞および周皮細胞を使用することができるかどうかを決定するために努力がまだ行われていない我々の知る限り、しかし、血管形成中の内皮細胞の挙動の研究にのみ焦点を当てていますこれら2つの細胞型は、血管新生の間にどのように相互作用するかを研究します。具体的には、ECおよび周皮細胞との間の関係を理解することは、血管の損失は微小血管虚血および末梢血管疾患10、11、12を含む、病理学的である疾患を研究するための貴重なものです。 ここでは、ヒトECおよび線維芽細胞成長因子（bFGF）と共にマトリックスゲル混合物にヒト由来周皮細胞を導入するプロトコルを記載しています。次いで、この混合物を皮下I注射することができますnはSCIDマウスの背は、完全に機能的な、周皮細胞被覆され、ハイブリッド血管の形成を可能にします。私たちのプロトコルが持つまたはSCIDマウスとどのように重要な血管新生エンドポイントの組織切片を分析するために人間の周皮細胞、配置があってもなくても、人間のECを含むマトリックスゲルプラグを準備する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>primary human pulmonary pericytes</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&amp;nbsp; Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>stock solution is 50 &amp;mu;g/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 &amp;mu;l and stored at -20 degrees</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screw top tubes, sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair hair removal cream</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra fine surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (paraformaldehyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

マトリックスゲルプラグ部は、図に示されているのECおよび周皮細胞の両方を含むプラグが、いくつかの灌流を表示するのに対し、代表的H＆Eおよび免疫蛍光染色は、ECからの2セクションは唯一のプラグは、主に血液で灌流されていないいくつかの船（左図2トップ、黒矢印）を表示しますCD31陽性のECのすぐ隣に正のSMA染色により?...

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K ビュー.  Stanford University. 私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。 

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An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

医学

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

免疫・感染学

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

発生生物学

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

神経科学

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

生物学

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Modified Matrix Gel Plug Assayによる血管新生研究の簡素化

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

著者スポットライト:Investigating Angiogenesis and Vessel Permeability Through a Modified Matrix Gel Plug Assay

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

要約

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アン

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

インビトロ血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

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生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

ペリサイトの発芽アッセイ内皮細胞ビーズを組み込む

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

血管新生研究のための改変 In Vivo マトリックスゲルプラグアッセイ

インビトロ血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ