Name: in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse
Uploaded: 2016-12-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
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Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Stanford University School of Medicine zugelassen. HINWEIS: Die Tiere sind unter anesthetization mit 3% Verdampfer Isofluran und 3% Zufuhr von O 2 -Gas. Die Verwendung von Tierarzt Salbe auf die Augen kann helfen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern. 1. Zellpräparation <ol><li> Wachsen humanen Endothel- und Perizyten Zellkulturen in 100 mm-Platten mit 10 ml der geeigneten Medien. Ersetzen Sie 10 ml frisches Medium alle 2 - 3 Tage, bis die Zellen erreichen 80% Konfluenz. <ol><li> Kultur Endothelzellen (ECs) in kompletten endothelialen Zellmedien (ECM), ergänzt mit Firma geliefert 5% fötales Rinderserum (FBS), 10% Penicillin / Streptomycin und 10% endothelialen Zellwachstumsergänzung. </li><li> Kultur pericytes in komplette pericyte Medien (PM), ergänzt mit Unternehmen lieferte 2% FBS, 10% Penicillin / Streptomycin und 10% pericyte Wachstum zu ergänzen. </li&gt; </ol></li><li> Bereiten Zellgemischen <ol><li> Berechne die erforderliche Anzahl von Zellen für die Versuchs- und Kontrollgruppen. HINWEIS: Jeder Stecker in der experimentellen Gruppe enthält eine Million (1 × 10 6) menschlichen ECs und zweihunderttausend (2 x 10 5) pericytes. Für die Kontrollgruppe enthält jeder Stecker 1,2 Millionen menschliche ECs nur. Die negative Kontrollgruppe hat nur Matrix-Gel. Jede Gruppe sollte mindestens vier Stecker umfassen, die zwei Mäuse erfordern würde, als Stecker können in jeder Seite eine Maus unteren Rücken injiziert werden. Drei Stecker würde als dreifacher Ausfertigung für das Experiment dienen und das vierte im Fall verwendet werden könnte, ausfällt. Bereiten Sie 25% mehr Zellen das zusätzliche Volumen des Gels entsprechen. </li><li> Sammeln und Zählen Zellen aus Kulturplatten. <ol><li> Zum Abnehmen Zellen, entfernen Medien und waschen Sie einmal mit Raumtemperatur 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Entfernen PBS, 1 ml 0,25% Trypsin / 2,21 mM EDTA, und nach 1 min. Wash-Zellen von der Platte durch 2 Hinzufügenml Medium und sammeln sich in einem 15-ml-Tube. </li><li> Zählzelle einer Zählkammer nach den Anweisungen des Herstellers verwendet wird. </li><li> Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen zu einem Pellet bei 400 xg für 5 min. Für die Versuchsgruppe, Zentrifuge sowohl ECs und Perizyten nach unten zusammen in einem Pellet. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Matrix Gelzubereitung <ol><li> Auftauen Matrix Gel vollständig bei 4 ° C für 4 Stunden oder über Nacht eine homogene Lösung zu erhalten. Kein Mischen erforderlich. </li><li> Aliquotieren Matrix Gel in 1,5-ml-Röhrchen und lagern bei 4 ° C. </li><li> Pre-Chill-sterile 1,5 ml-Röhrchen und 28 G 1 cc Insulinspritzen bei 4 ° C. Vorsicht: Halten Sie Matrix-Gel auf Eis zu allen Zeiten. </li><li> Mischen Sie kalt Matrix-Gel mit bFGF bei einem Volumenverhältnis von 1: 100 (Endkonzentration von bFGF = 0,5 ug / ml; bFGF Stammlösung = 50 &amp; mgr; g / ml) Nach dem Mischen Matrix-Gel-Lösung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, Inkubation auf Eis für 30 - 60 min before Mischen mit den Zellen in Schritt 3.1. HINWEIS: auftauen Lager bFGF vor dem Mischen. Berechnen Sie die Anzahl der Stecker für die Injektion benötigt. Zum Beispiel erfordert jeder Stopfen 200 &amp; mgr; l Matrix Gel. Daher 25% Extra-Gel herzustellen. </li></ol> 3. Mix Matrix Gel mit Zellen <ol><li> Für jede Gruppe Zellpellet mit dem berechneten Volumen der Matrix-Gel mit bFGF (geeignete Zellzahl enthält). Vorsichtig mischen Schäumen zu vermeiden und in der 15-ml-Röhrchen auf Eis belassen, bis Mäuse zur Injektion hergestellt werden. </li></ol> 4. Maus-Vorbereitung <ol><li> Anesthetize 1 SCID - Mäuse für 5 min in 3% Isofluran plus 3% O 2 in einer Induktionskammer. Konzentrieren Sie sich auf eine experimentelle Gruppe oder 2-Mäuse, zu einer Zeit. </li><li> Entfernen Sie die Maus aus der Induktionskammer, auf ein nach unten Bauchseite Heizkissen und schnell eine Schnauze Düse mit der Maus Gesicht über eine nicht-Rückatmungssystem befestigen Anästhesie während des inje zu liefernction Verfahren. Schalten Sie den Gasstrom aus der Induktionskammer zu dem Nicht-Rückatmungssystem und senken den Gasdruck auf 1,5% Isofluran und 1,5% O 2. </li><li> Entfernen Sie Haare aus den beiden seitlichen Hinter Regionen (etwa 1 cm Durchmesser) mit einem Rasierapparat oder Enthaarungscreme. </li><li> Wischen Sie den Hautbereich mit einer 70% igen Alkohol-Pad. </li><li> Bringen Sie die Maus an die Induktionskammer und wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,4 mit der zweiten Maus. </li></ol> 5. Matrix-Gel-Injektion <ol><li> Bereiten Sie eine Maus für die Injektion von der Nichtrückatmungssystem befestigt und nach unten auf das Heizkissen Bauchseite platzieren. </li><li> Legen Sie das Matrix-Gel in eine vorgekühlte 28 G 1 cc-Insulinspritze eine Maus zu einem Zeitpunkt. <ol><li> Laden Sie die komplette 500 &amp; mgr; l Volumen der Matrix-Gel für zwei Stecker (200 ul pro Stecker plus 25% extra) in die Spritze. </li><li> Achten Sie darauf, die Matrix-Gel in die Mäuse innerhalb von 3 Minuten des Ladens der Zellen in die Spritze zu injizieren, um die ce zu verhindernlls aus zur Seite der Spritze Absetzen und Matrix Gel zu verhindern Innenseite der Spritze verfestigt. </li></ol></li><li> Heben Sie die Rückenhaut subkutanen Raum zu lokalisieren, zu injizieren dann 200 &amp; mgr; l der Matrix Gel langsam und gleichmäßig in den subkutanen Raum von der Rückseite hinteren Teil des Brustkorbs. </li><li> Entfernen Sie die Injektionsnadel langsam, wobei darauf geachtet, Matrix Gel zu verhindern, dass ein Auslaufen der Injektionsstelle. Eine Beule wird bei der Injektionsstelle bilden. Wischen Injektionsstelle mit einem Alkoholtupfer. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte Injektion 5,2-5,5 auf der anderen Seite der Maus zurück, dann mit der Maus auf dem Rücken lässt 1 min Gelieren der Matrix-Gel auf dem Heizkissen zu ermöglichen. </li><li> Skizzieren Sie die beiden Höcker einen Permanent-Marker mit der Beule nach 14 Tagen zu identifizieren. Nachdem ich einige Haare wieder wächst, wird es leichter sein, die Beule zu finden. </li></ol> 6. Matrix Gelpfropfen Isolation: 14 Tage nach der Injektion <ol><li> Euthanize die Mäuse auf humane Weise durch das Tier ausgesetzts bis&gt; 5 min Kohlendioxid Inhalation durch zervikale Dislokation gefolgt Tod zu gewährleisten. </li><li> Entfernen Sie die Matrix Gelpfropfen auf der Rückseite der Maus. <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig nachgewachsenen Haare um Injektionsstelle, wo der Stecker durch Wiederholen von Schritt 4.3 befindet. Die Markierungslinie zeigt die Größe der ursprünglichen Beule unter der Haut. </li><li> Excise den Stecker zusammen mit den umgebenden Haut und Muskelschichten angebracht auf den oberen und unteren Seiten des Steckers sind. <ol><li> Mit feinen chirurgischen Schere, machen einen Einschnitt an der markierten Grenze des Steckers, die senkrecht zur Haut ist und geschnitten, um den Muskel unterhalb der Stecker durch. Dann sorgfältig entlang der markierten Rand um den Umfang des Stopfens geschnitten. </li><li> Ziehen Sie den Stecker, halten es zwischen der Haut und Muskelschichten eingebettet ist. sofort gründlich in einem kleinen Becher mit 1x PBS überschüssiges Blut abzuwaschen. Der Stecker ist nun bereit, festgelegt werden (nächster Schritt, 6.3). </li></ol></li></ol></li><li> Befestigen Sie die plug in 4% Paraformaldehyd. <ol><li> Platzieren Sie den gesamten Stecker, einschließlich der Haut und Muskelschichten, in einem 50-ml-Röhrchen mit 25 ml 4% Paraformaldehyd für 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne zu schaukeln. Am nächsten Tag übertragen Sie den Stecker in 25 ml 70% Ethanol für weitere 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. HINWEIS: Die beim Umgang Paraformaldehyd mit Vorsicht. Trag Handschuhe. </li></ol></li></ol> 7. Paraffin Prozess der Matrix Gelpfropfen <ol><li> Bereiten Sie den Stecker für die Paraffineinbettung. <ol><li> Richten Sie den Stecker wie in 1a gezeigt; Platzieren Sie den Stecker in eine Gewebekassette, so dass die Seite des Steckers nach oben zeigt und die beiden Haut und Muskelschichten sind über die Oberfläche des Gewebeblocks sichtbar, die zuerst während des Schneidens geschnitten wird. </li></ol></li><li> Paraffin einbetten den Stecker nach Standardparaffineinbettung Protokolle 13. </li><li> Schneiden Sie 8 - 10 &amp; mgr; m dicke Abschnitte aus der Gewebeblock und montieren auf Mikroskop accor gleitetding Standard Paraffin sectioning Protokolle 13. </li><li> Lagern Sie die Folien in einem kühlen, trockenen Ort bei Raumtemperatur, bis sie bereit für die Färbung. </li></ol> 8. Stain Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin - Färbung (H &amp; E) 13 <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l H &amp; E-Lösung auf den Abschnitt und Inkubation für 1 bis 5 min, oder bis es klare Kontrast zwischen blauen Kernen und rosa Zytoplasma in einer Zelle, wie bei 10-facher Vergrößerung unter einem aufrechten Lichtmikroskop betrachtet. Achten Sie darauf, nicht zu lassen, jede H &amp; E-Lösung das Ziel berühren. </li><li> Wash H &amp; E-Lösung von Dunking die Folie in einen großen Becher Leitungswasser, dann legen Sie die Folie in einem Rack in den Becher und bündig mit fließendem Wasser für 2 Minuten von der Folie ab. </li><li> Move 9,8 Schritt die Folien zu montieren. </li></ol> 9. Stain Andere Folien für Menschen Kapillaren und Perizyten <ol><li> De-Paraffin säubern die Gewebeschnitte durch die Folien über 100% Xylol Passieren zweimal, 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und schließlich 1x PBS für jeweils 5 min bei Raumtemperatur. Verlassen Dias in 1x PBS, bis zum nächsten Schritt. </li><li> Kochen Sie die Abschnitte in Antigen-Retrieval-Lösung. <ol><li> In einem 2-Liter-Becher, bereiten Antigen-Retrieval-Lösung unter Verwendung von 1x Citratpuffer (pH 7,0) bei 95 ° C auf einem Heizblock Sieden. </li><li> Nach dem Kochen legen Sie die Folien in einem Metallgestell und unterzutauchen für 20 Minuten in die siedende Antigen-Retrieval-Lösung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Becher aus dem Heizblock mit den noch unter Wasser gleitet und die Lösung zu langsam für etwa 30 min auf Raumtemperatur zurück. </li><li> Legen Sie die Folien in 1x PBS bis zum nächsten Schritt. </li></ol></li><li> Blockieren Sie die Abschnitte in Blockierungspuffer (1x PBS, 5% Ziegenserum, 00,3% Triton X-100). <ol><li> Zeichnen Sie einen hydrophoben Kreis um die Ränder eines jeden Abschnitts mit einem PAP Stift. </li><li> Legen Sie die Folien in einer Luftfeuchtigkeit Schale mit destilliertem Wasser auf dem Boden des Fachs. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l Blockierungspuffer auf die Abschnitte dafür, dass das gesamte Gewebe von Flüssigkeit bedeckt ist (kann mehr als 100 &amp; mgr; l erfordern). </li><li> Inkubieren Abschnitte mit Puffer für 1 h blockiert. </li></ol></li><li> Inkubieren Abschnitte mit dem primären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit zwei primären Antikörpern jeden Abschnitt Sonde für CD31 (ECs) und smooth muscle actin (Perizyten) verdünnt in Verdünnungspuffer (1 × PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100). HINWEIS: Hier, anti-CD31-Konzentration ist 01.50 und anti-Glattmuskelaktin Konzentration ist 1: 300. </li><li> Inkubieren der Abschnitte über Nacht bei 4 ° C mit 100 &amp; mgr; l primärer Antikörper in einer Feuchtigkeitsfach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST (1x PBS + 0,1% TweEN20) für jeweils 5 min waschen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit sekundären Antikörper. <ol><li> Vorbereitung einer Lösung mit einem Fluorophor konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper der Anti-CD31-Kaninchen-Antikörper in Verdünnungspuffer verdünnt, zu erkennen. <ol><li> HINWEIS: Die Glattmuskelaktin primären Antikörper bereits mit einem Cy3 Fluorophor konjugiert ist, so ist keine sekundäre Antikörper-Färbung benötigt. Ziege-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörperkonzentration beträgt 1: 250. </li></ol></li><li> Inkubieren Sie die Abschnitte 1 h mit 100 ul sekundären Antikörper in der Feuchtigkeit Fach destilliertes Wasser enthält. </li></ol></li><li> Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBST für jeweils 5 min waschen. </li><li> Montieren Sie die Dias. <ol><li> Pipette 2 - 3 Tropfen (~ 40 - 60 &amp; mgr; l) von Antifade Montagelösung mit DAPI Kernfärbung auf jedem Abschnitt. </li><li> Sanft legen Sie eine Nr. 1.5 Deckglas über die Abschnitte und Montagelösung, so dass die Flüssigkeit über die Abschnitte, um sich auszubreiten und zu den Ränderndas Deckglas. Verwenden Sie vorsichtig mit einem Finger zu drücken aus Luftblasen, die über den Abschnitt befinden können. </li><li> Lassen Sie die Folien für mindestens 1 Stunde trocknen, bevor Handhabung. </li></ol></li></ol> 10. Quantify Kapillar - Dichte und Struktur 14 <ol><li> Zähle die Anzahl der Kapillaren in H &amp; E gefärbte Schnitte, ausgedrückt als # / mm 2. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern an einem aufrechten Lichtmikroskop unter 40-facher Vergrößerung. HINWEIS: Die Kapillaren als Rohre mit roten Blutkörperchen gefüllt identifiziert. </li><li> Alternativ kann anstelle der manuellen Zählen Kapillaren verwenden Bildanalysesoftware (zB Wimasis Image Analysis) verschiedene Angiogenese Parameter wie Gefäßzahl, mittlere Fahrzeuglänge und Durchmesser und Verzweigungspunkte zu quantifizieren. </li></ol></li><li> Analysieren kapillare Struktur in Immunofluoreszenz-gefärbten Schnitten. <ol><li> Erwerben Sie Fotos von vier verschiedenen Feldern auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskopmit FITC und TxRed Filterwürfel. <ol><li> Verwenden Sie ein FITC Würfel Bild ECs durch Anregung bei 488 nm Wellenlänge und mit einem TxRed Würfel Bild pericytes durch Anregung bei 594 nm Wellenlänge. <style type="text/css">p.p1 {margin: 0.0px 0.0px 0.0px 0.0px; font: 8.0px Arial}
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	<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+angiogenesis.">Mechanisms of angiogenesis.</a> Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).</li><li>Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+pericytes+in+angiogenesis.">The role of pericytes in angiogenesis.</a> Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).</li><li>Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+three+dimensional+collagen+matrix+models+of+endothelial+lumen+formation+during+vasculogenesis+and+angiogenesis.">In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).</li><li>Liu, Y., Senger, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-specific+activation+of+Src+and+Rho+initiates+capillary+morphogenesis+of+endothelial+cells.">Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells.</a> FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).</li><li>Grant, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+endothelial+cells+with+a+laminin+A+chain+peptide+(SIKVAV)+in+vitro+and+induction+of+angiogenic+behavior+in+vivo.">Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo.</a> J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).</li><li>Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+modulation+of+endothelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta+depends+upon+the+composition+and+organization+of+the+extracellular+matrix.">Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix.</a> J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).</li><li>Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+10-day-old+chick+embryo+model+for+studying+angiogenesis.">Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).</li><li>Yuan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Wnt/planar+cell+polarity+pathway+is+required+for+pericyte+recruitment+during+pulmonary+angiogenesis.">Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis.</a> Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).</li><li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice.">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).</li><li>Chen, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pericytes+for+ischemic+heart+repair.">Human pericytes for ischemic heart repair.</a> Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).</li><li>Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+blood+vessels,+endothelial+cells,+and+vascular+pericytes+in+insulin+secretion+and+peripheral+insulin+action.">The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action.</a> Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).</li><li>Ricard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+pericyte+coverage+mediated+by+endothelial-derived+fibroblast+growth+factor-2+and+interleukin-6+is+a+source+of+smooth+muscle-like+cells+in+pulmonary+hypertension.">Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).</li><li>Buchwalow, I. B., Bocker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).</li><li>Tata, D. A., Anderson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+the+investigation+of+capillary+structure.">A new method for the investigation of capillary structure.</a> J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).</li></ol>

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Die Matrix Gelpfropfen Assay hat eine bequeme und leistungsfähige Methode zur Bewertung der Genregulation in Angiogenese, angiogene und antiangiogene Verbindungen in vivo erwiesen, und in vitro - Tests zu ergänzen. Hier beschreiben wir im Detail eine neuartige Matrix Gelpfropfen Test der menschlichen Angiogenese, die die Interaktion zwischen Endothelzellen und Perizyten während Gefäßbildung untersucht. Es gibt einige neuartige und wichtige Schritte in diesem Protokoll....

Die Angiogenese ist der Prozess , durch den neue Blutgefäße aus einem bereits bestehenden Gefäßnetz gebildet werden 1 und steht im Mittelpunkt der laufenden Forschung in vielen Bereichen von der normalen Entwicklung von Krankheiten reichen. Dieser dynamische Prozess beinhaltet die Proliferation und Migration von endothelialen Zellen (ECs) und die Rekrutierung von Perizyten eines Gefäßrohr zu konstruieren , die in Richtung auf die Seite gerichtet ist , die zwei Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr benötigt. Zur Untersuchung dieser Prozess einen ebenso dynamischen Test erfordert, vor allem eine, die die dreidimensionale Natur der Schlauchbildung rekapitulieren kann. In - vitro - 3D - Matrix - Assays wurden entwickelt , um diesen Bedarf zu adressieren und gearbeitet haben und Forscher zu ermöglichen , die einzelnen Schritte in Raum und Zeit zu definieren , in denen die Angiogenese Platz 3 nimmt, 4, 5, 6. Allerdings sind diese in vitro 3D - Matrix - Modelle beschränkt auf das Studium nicht-durchbluteten Gefäßen eined fehlt daher kritische Komponenten relevant für die Prozess der Angiogenese (zB Wachstum zirkulierenden und hemmenden Faktoren, unnatürliche Spannung / Kräfte über das Gefäßbett) und nicht die komplexe Umwelt in lebendem Gewebe zu simulieren. Um dieser Einschränkung, mehrere in - vivo - Angiogenese - Assays wurden 7 entwickelt, einschließlich der Matrix Gelpfropfen Assay, der im Mittelpunkt unseres Berichts wird 8, 9. Die Matrix Gelpfropfen Assay ist ein etabliertes in vivo - Angiogenese - Test, der den Forschern anspricht , wie es eine robuste Plattform bietet die Rollen von verschiedenen Zellen und Substanzen in die Angiogenese zu testen. Matrix-Gel ist ein kommerziell erhältlicher Basalmembran Lösung, die von dem Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maus-Sarkom-Zelllinie sekretiert wird, die bei 37 ° C in ein gelartiges Material erstarrt. Die Matrix-Gel kann mit Zellen und / oder Substanzen, wie Wachstumsfaktoren, gemischt werden und injesubkutan in die Maus cted. Der Host-ECs wird den Stecker über 14 Tage überfallen, ein Gefäßnetz bilden und mit dem Blut des Wirts durchblutet sind. Bislang Matrix Gelpfropfen Assays ausschließlich auf die Untersuchung der endothelialen Zellverhalten während der Angiogenese konzentriert sich jedoch auf bestem Wissen ist keine Anstrengung noch aus, um festzustellen, ob dieser Assay zur Kokultur Endothelzellen und Perizyten verwendet werden können, zu untersuchen, wie sich diese beiden Zelltypen während der Angiogenese zusammenwirken. Insbesondere ist wertvoll zwischen ECs und Perizyten die Beziehung Verständnis für Krankheiten zu studieren , wo Blutgefäßverlust pathologisch, einschließlich mikrovaskulären Ischämie und periphere Gefäßerkrankungen 10, 11, 12. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das Perizyten Menschen stamm an die Matrix Gelmischung zusammen mit menschlichen ECs und Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) einführt. Diese Mischung kann dann i subkutan injiziert werdenn die dorsum von SCID-Mäusen die Bildung von voll funktionsfähig, pericyte beschichtet, Hybridgefäße zu ermöglichen. Unser Protokoll beschreibt, wie Matrix Gelpfropfen, die menschliches ECs vorzubereiten entweder mit oder ohne menschliches pericytes, Platzierung in SCID-Mäuse und wie die histologischen Schnitte für kritische Angiogenese-Endpunkte zu analysieren.

<table><tbody><tr><td>PBS (Phosphate buffered saline)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/0.53 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Media (ECM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td>includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>Pericyte Media (PM) kit</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td>includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing</td></tr><tr><td>primary human pulmonary microvascular endothelial cells</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>primary human pulmonary pericytes</td><td>Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative</td><td></td><td>this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.&amp;nbsp; Cells used at passage 1-4</td></tr><tr><td>bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>stock solution is 50 &amp;mu;g/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 &amp;mu;l and stored at -20 degrees</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td><td>BD</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>28 G 1 cc Insluin Syringe</td><td>BD</td><td>329410</td><td></td></tr><tr><td>SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>5557</td><td>NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age</td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screw top tubes, sterile</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Life Technologies</td><td>8899</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Nair hair removal cream</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD31 primary antibody</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-B4737</td><td>working solution is 1:50</td></tr><tr><td>anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>working solution is 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11008</td><td>working solution is 1:250</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI solution</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>microscope slides</td><td>VWR</td><td>48300-047</td><td></td></tr><tr><td>no. 1.5 cover slips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>citrate buffer 10x</td><td>Millipore</td><td>21545</td><td></td></tr><tr><td>extra fine surgical scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Formalin (paraformaldehyde)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>245-685</td><td></td></tr><tr><td>Tissue cassettes</td><td>Simport</td><td>M492-12</td><td></td></tr><tr><td>goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo study of human endothelial-pericyte interaction using the matrix gel plug assay in mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Repräsentative H &amp; E und Immunfluoreszenzanfärbung von Matrix Gelpfropfen Abschnitte sind in Abbildung 2 Abschnitte von EG nur Stecker einige Schiffe angezeigt werden gezeigt, die meist nicht durchblutet (Abbildung 2 oben links, schwarze Pfeile) , während Stecker , die sowohl ECs und Perizyten Anzeige mehrere perfundierter Schiffe mit größerem Durchmesser und vollständige pericyte Abdeckung, wie durch positive SMA Färbung unmittelbar angrenzen...

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In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen.

In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

9.6K Aufrufe.  Stanford University.  Wir stellen ein Protokoll menschlichen endothelial-pericyte Wechselwirkungen in Maus unter Verwendung einer Variation der Matrix Gelpfropfen Angiogenese-Assay zu untersuchen. 

Serie: In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Forschung

Medizin

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Immunologie und Infektion

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Entwicklungsbiologie

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Neurowissenschaften

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Strategische Endothelzell Tubusbildung Assay: Ein Vergleich extrazellulären Matrix und Wachstumsfaktor Reduzierte Extrazellulärmatrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Biologie

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired factors are introduced into cold-liquid ECM-mimic gel which, after subcutaneous injection, solidifies to form an environment mimicking the cancer milieu. This matrix permits the penetration of host cells, such as endothelial cells, and therefore, the formation of vasculature.
Herein we propose a new modified matrigel plug assay, which can be exploited to illustrate the angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells, as opposed to a specific factor (e.g., bFGF and VEGF) or agent. The plug containing ECM-mimic gel is utilized to introduce the host (i.e., mouse) with a pool of factors secreted to the C.M. of fast-growing tumor-generating glioblastoma cells. We have previously described an extensive comparison of the angiogenic potential of U-87 MG human glioblastoma and its dormant-derived clone, in this system model, showing induced angiogenesis in the U-87 MG parental cells. The C.M. is prepared by filtering collected media from confluent tissue culture plates of either cell line following 48 hr incubation. Hence, it contains only factors secreted by the cells, without the cells themselves. Described here is the combination of two imaging modalities, microbubbles contrast-enhanced ultrasound imaging and intravital fibered-confocal endomicroscopy, for an accurate, real-time characterization of the extent, morphology and functionality of newly-formed blood vessels within the plugs.

We describe a matrigel plug assay to illustrate angiogenic potential of a pool of factors secreted by cancer cells using two complementary imaging modalities, ultrasound and endomicroscopy. The matrigel, an extracellular matrix (ECM)-mimic gel, is utilized to introduce the host (mouse) with angiogenic factors secreted to the conditioned media (C.M.).&#160;

Überwachungsfunktionen und Morphologie der Gefäßversorgung von Faktoren durch schnell wachsende Tumor erzeugende Zellen sezerniert rekrutiert

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for phenotypic drug discovery (PDD) programs. Although these novel devices could predict the safety and efficacy of investigational drugs in humans more accurately, their development to the clinic still strongly rely on mammalian data, notably the use of mouse disease models. In parallel to human organoid or organ-on-chip disease models, the development of relevant in vitro mouse models is therefore an unmet need for evaluating direct drug efficacy and safety comparisons between species and in vivo and in vitro conditions. Here, a vascular sprouting assay that utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies (EBs) is described. Vascularized EBs cultured onto 3D-collagen gel develop new blood vessels that expand, a process called sprouting angiogenesis. This model recapitulates key features of in vivo sprouting angiogenesis-formation of blood vessels from a pre-existing vascular network-including endothelial tip cell selection, endothelial cell migration and proliferation, cell guidance, tube formation, and mural cell recruitment. It is amenable to screening for drugs and genes modulating angiogenesis and shows similarities with recently described three-dimensional (3D) vascular assays based on human iPSC technologies.

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

This assay utilizes mouse embryonic stem cells differentiated into embryoid bodies cultured in 3D-collagen gel to analyze the biological processes that control sprouting angiogenesis in vitro. The technique can be applied for testing drugs, modeling diseases, and for studying specific genes in the context of deletions that are embryonically lethal.

In vitro Dreidimensionaler Keimtest der Angiogenese unter Verwendung embryonaler Stammzellen der Maus für die Modellierung von Gefäßerkrankungen und Arzneimitteltests

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

Vereinfachung von Angiogenese-Studien mit einem modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

Modified In Vivo Matrix Gel Plug Assay for Angiogenesis Studies

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized equipment, or are hard to perform for subsequent quantitative analysis. Here we present a modified matrix gel plug assay to evaluate angiogenesis in vivo. In this protocol, vascular cells were mixed with matrix gel in the presence or absence of pro-angiogenic or anti-angiogenic reagents, and then subcutaneously injected into the back of recipient mice. After 7 days, phosphate buffer saline containing dextran-FITC is injected via the tail vein and circulated in vessels for 30 min. Matrix gel plugs are collected and embedded with tissue embedding gel, then 12 &#181;m sections are cut for fluorescence detection without staining. In this assay, dextran-FITC with high molecular weight (~150,000 Da) can be used to indicate functional vessels for detecting their length, while dextran-FITC with low molecular weight (~4,400 Da) can be used to indicate the permeability of neo-vessels. In conclusion, this protocol can provide a reliable and convenient method for the quantitative study of angiogenesis in vivo.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Angiogenese und Gefäßpermeabilität durch einen modifizierten Matrix-Gel-Plug-Assay

The method presented here can evaluate the effect of reagents on angiogenesis or vascular permeability in vivo without staining. The method uses dextran-FITC injection via the tail vein to visualize neo-vessels or vascular leakage.

Modifizierter In-vivo-Matrix-Gel-Plug-Assay für Angiogenese-Studien

Several models have been developed to investigate angiogenesis in vivo. However, most of these models are complex and expensive, require specialized ...