Evidências emergentes implicaram a contribuição de macrófagos de gânglios de raiz dorsal para o desenvolvimento da dor neuropática e reparação axonal no contexto de lesão nervosa. Rapidamente, a resposta dos macrófagos de gânglios de raiz dorsal é desejada para identificar os fatores neuroimunes desconhecidos. Aqui demonstramos como nosso laboratório isola rapidamente e efetivamente macrófagos da gânglio raiz dorsal usando um protocolo de dissociação mecânica sem enzimas.
Este protocolo é muito menos demorado comparado aos protocolos enzimáticos padrão, e nós o usamos rotineiramente para nossa análise de classificação celular ativada por fluorescência. Antes de iniciar o experimento, prepare a solução de trabalho do meio gradiente de densidade misturando nove volumes do meio com um volume de HBSS 10X sem cálcio e magnésio e mantenha-o no gelo. Confirme se o mouse está totalmente anestesiado pela falta de resposta ao aperto da pata traseira.
Comece colocando um rato anestesiado dentro de um capô de fumaça química na posição supina com quatro patas presas com fita adesiva. Use fórceps para levantar a pele abaixo da caixa torácica. E então com uma tesoura cirúrgica, faça uma pequena incisão para expor o fígado e o diafragma.
Usando a mesma tesoura, corte o diafragma e a caixa torácica. E então abra a cavidade pleural para expor o coração pulsante. Em seguida, com a tesoura de íris, corte rapidamente o apêndice atrial direito.
Uma vez notado o sangramento, insira uma agulha de calibre 30 na extremidade posterior do ventrículo esquerdo e injete lentamente 10 mililitros de PBS 1X pré-refrigerado para perfundir o animal. Para realizar laminectomia dorsal, coloque o rato na posição propensa. Use um bisturi tamanho 11 para fazer duas incisões longitudinais laterais profundas desde a região torácica até a região sacral.
Em seguida, remova a pele expondo a camada muscular dorsal. Em seguida, com Friedman-Pearson rongeur, retire os tecidos e músculos conjuntivos até que os processos da coluna lombar lumbosacral e processos transversais bilaterais sejam expostos. Primeiro, use um rongeur Friedman-Pearson para abrir cuidadosamente a coluna vertebral dorsal, depois alternar entre uma tesoura de mola Friedman-Pearson e Noyes para remover os ossos vertebrais, expondo a medula espinhal com nervos espinhais intactos ligados.
Disseca cuidadosamente drg lombar ipsilateral e contralateral. Coloque-o em um mililitro de cálcio gelado e 1X HBSS sem magnésio em um homogeneizador de tecido Dounce. Homogeneize o tecido DRG no homogeneizador Dounce com um pilão solto por 20 a 25 vezes.
Coloque um filtro de nylon estéril de 70 micrômetros em um tubo cônico estéril de 50 mililitros. Use 800 microliters de código de gelo 1X HBSS para molhar o coador de células. Use uma pipeta para coletar a suspensão do tecido homogeneizado do homogeneizador no coador de células molhadas e colecioná-la no tubo cônico de 50 mililitros.
Enxágüe o homogeneizador duas vezes com 800 microliters de hbss 1X de gelo frio, coletando o líquido no mesmo tubo cônico de 50 mililitros para aumentar o rendimento. Adicione 1,5 mililitros de gradiente de densidade isotônica gelada equilibrado em um tubo de frasco de poliestireno de cinco mililitros estéreis. Transfira a célula homogeneizar do tubo cônico de 50 mililitros para este tubo de frasco.
E pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Adicione mais 500 microliters de 1X HBSS para selar a parte superior. Centrifugar as células a 800 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Aspire cuidadosamente o supernasal contendo mielina no meio sem perturbar a pelota celular na parte inferior do tubo. Adicione 100 microlitadores de PBS contendo 5% de soro bovino fetal à pelota e suspenda as células DRG. Em seguida, adicione o anticorpo APC do mouse alfa CX3CR1 às células e incubar no escuro a quatro graus Celsius por uma hora.
Lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS. Centrifugar as células a 360 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Aspire o supernascer, e depois suspenda novamente a pelota celular em 300 microliters de PBS para análise de fatos.
Após injeções intraperitoneais de dimerizer de proteína de ligação FK AP em camundongos MaFIA para esgotar macrófagos, houve uma perda significativa de células positivas de GFP nos DRGs dos camundongos tratados com AP em comparação com camundongos tratados com veículos controlados. A análise dos fatos revelou um esgotamento bem-sucedido da alta população de GFP em camundongos tratados com AP e demonstrou a alta qualidade das células isoladas. 4% do total de células isoladas do DRG do animal tratado de veículos foram macrófagos elevados de GFP.
Em contraste, apenas 0,4% do total de células DRG eram macrófagos elevados gfp em camundongos tratados com AP. Células DRG mecanicamente isoladas de ratos do tipo selvagem foram manchadas com anticorpos alfa mouse CX3CR1-APC. 6% das células DRG eram macrófagos positivos CX3CR1.
Quando a viabilidade celular foi avaliada com iodeto propidium, revelou que mais de 80% das células DRG recém-isoladas eram viáveis. Se notar o rendimento celular insatisfatório, pode-se suspeitar de homogeneização insuficiente ou excessiva do tecido DRG. Além disso, a dissecção drg pode exigir prática repetida para iniciantes.
Provavelmente a aplicação do nosso protocolo pode ser expandida para estudar outras células não-neuronais, como células satélites e células T. Outros estudos podem ser necessários para confirmar a eficácia do isolamento celular.
