Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção: PO1 HL55798 (para KL) e American Heart Association Scientist Desenvolvimento Grant 0525532U (para EG).

1. Isolamento de aortas de camundongos Aprovação do comitê institucional IACUC do procedimento é necessário para trabalhar com camundongos. <ol><li> Prepare heparinzed PBS, acrescentando 1.000 unidades de heparina sódica a 50 ml de PBS e invertendo o tubo para misturar. Prepare um tubo de coleta vazio para o sangue e um tubo de coleta contendo PBS para cada aorta a ser coletado. Manter todos os tubos no gelo. </li><li> Heparinizar uma seringa de sangue de desenho (0,1 ml de Heparina sódica 1.000 U / ml), prepare instrumentos cirúrgicos (dois pares de fórceps curvado, um par de tesouras de dissecação, e um par de microshears), e um estágio de dissecação para a dissecção. </li><li> Euthanize um rato usando dióxido de carbono em uma câmara aprovou seguintes NIH e Institucional políticas comitê IACUC sobre a eutanásia de roedores. Verificar a eficácia antes de transferir o mouse para o estágio de dissecação. </li><li> Brevemente absorver o mouse com etanol 70% e apertar o mouse para o estágio de dissecação. Tirar sangue do rato através de punção cardíaca. </li><li> Abra as cavidades abdominal e torácica. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 g, completamente perfundir a vasculatura com PBS contendo 2% de heparina para remover completamente sangue dos vasos por punção cardíaca. Certifique-se que não há sangue dentro dos tecidos da aorta. A perfusão deve ser realizada lentamente, com pouca pressão para garantir que todas as placas na parede dos vasos permanecem intactos. </li><li> Dissecar e remover os órgãos viscerais, órgãos geniturinários, o diafragma eo baço, deixando os rins, coração, aorta e intacta. </li><li> Dissecar cuidadosamente os tecidos adiposo e nós linfáticos para-aórticos longe da aorta, deixando a aorta e adventícia intacta. Recolher toda a aorta, incluindo arco aórtico, ascendente, descendente, torácica, abdominal e porções. Coloque a aorta isolada em um tubo de coleta com PBS. Durante o procedimento de isolamento, tente manter a umidade do vaso. </li></ol> 2. Preparação de suspensões única célula <ol><li> Criar uma 1X Aorta dissociação Solução estoque de enzimas (ADES) (125 U / ml de colagenase tipo XI, 60 do tipo U / ml Hialuronidase 1-s, 60 U / ml DNase I, e 450 U / ml de colagenase tipo I, em 2,5 ml de PBS, modificado a partir Galkina et al. 7). Todas as enzimas são da Sigma-Aldrich. Coloque a solução enzimática de ações no gelo. </li><li> Remover o PBS do tubo de coleta contendo a aorta. Adicionar 2,5 ml de 1X ADES a cada aorta. Corte o aortas em pedaços pequenos para facilitar a digestão enzimática ou deixar toda a aorta intacta. Incubar as aortas com a solução de enzima 1X por 1 hora a 37 ° C (mais lenta agitação é opcional). </li><li> Após a incubação de 1 hora, preparar suspensões única célula da aorta digerido pelo corte as aortas além e passá-los através de um filtro de células 70 mM em tubos de 5 ml de polipropileno FACS (BD Falcon). Agregar as células por centrifugação (400xg, a 5 minutos, 4 ° C). </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão FACS (PBS suplementado com BSA 1% e 0,05% NaN 3) e determinar quantas células estão presentes na suspensão celular aórtica usando azul de tripano, um hemocitômetro, e um microscópio de luz. O número total de células obtidas após a digestão vai depender da idade do mouse e dieta ou a gravidade da aterosclerose. </li></ol> 3. Coloração citometria de fluxo <ol><li> Rotular um número apropriado de sondas novas FACS. Em geral, os experimentos de citometria de fluxo deve ter um tubo de controle não-manchado, conjunto de tubos de cor única, apropriada fluorescência-menos-um controles (FMO) 8, controles isotipo apropriado, e um conjunto de tubos experimental. Uma vez que há um número limitado de leucócitos aórtica que podem ser isoladas, os leucócitos do baço pode ser usado para executar a coloração único controle. </li><li> Nós usamos um protocolo de citometria de fluxo padrão para manchar suspensões de células de aorta. Resumidamente, a transferência de uma alíquota de 0,5-1x10 6 células de uma suspensão de células de aorta em um tubo FACS (s). Adicionar 1 ml de tampão FACS e agregar as células por centrifugação. Retire o sobrenadante das células peletizada por decantação. </li><li> Prepare Fc solução bloco e cocktails de anticorpos para os tubos experimental, de fluorescência-menos-um tubos e tubos de isotipo. Adicionar 100μl de Fc bloco na FACS buffer (14.2μg/ml, clone 2.4G2) para todos os tubos e agite suavemente dedo ou vortex para ressuspender as células. Incubar as amostras por 15-20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare coloração de anticorpos, coloração isotipo ou cocktails coloração FMO controle. Determinar a concentração ideal de anticorpos em seus experimentos de titulação preliminar. Na presença de bloqueio de Fc, adicione cocktails de anticorpos (100ul/0.5-1.0x10 6 células) para os tubos de amostra. Incubar por 20-30 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão FACS a cada tubo, vortex para misturar e agregar as células por centrifugação. Repita o procedimento mais uma vez. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspenderas células peletizadas em 300 ul de PFA 2%. Executar os exemplos em um citômetro de fluxo. <ul><li> Nota: Normalmente anticorpo anti-CD45 (marcador de antígeno leucocitário comum) é adicionado a todas as amostras, a fim de portão CD45 + leucócitos depois 7 Além disso, CD45 FMO e controles isotipo deve ser usado inicialmente para colocar o portão CD45 + leucócitos como. CD45 expressão pode variar entre os leucócitos. </li><li> Nota: Para detectar baixa densidade expressar antígenos de superfície ou antígenos evento baixo, use &quot;fluorocromos brilhante&quot; como o R-Ficoeritrina (PE) ou Allophycocyanin (APC). Além disso, eventos raros pode ser detectado por vários pooling aortas combinados juntos, no entanto, se mais de um milhão de células são usadas, a quantidade de anticorpos utilizados para ensaio deve ser aumentado proporcionalmente. </li><li> Nota: Para garantir que não há contaminação de sangue mínima nas aortas isoladas e, consequentemente, a suspensão de células de aorta, em alguns experimentos coloração adicional foi realizada para TER-119, 7 um antígeno expresso por células vermelhas do sangue (RBC). O número de RBC para as células brancas do sangue (WBC) no sangue é de aproximadamente 10x10 6 células / mL para células 8x10 3 / mL. Com base na expressão do TER-119 em amostras de aorta, o percentual de derivados do sangue glóbulos brancos do sangue na amostra pode ser calculada. Normalmente temos menos de 0,02% de derivados do sangue WBC em amostras da aorta. (Fig.1) </li><li> Nota: Como o tratamento enzimático pode afetar a expressão dos antígenos de superfície, a resistência à digestão enzimática deve ser determinada para os antígenos de interesse. Resumidamente, linfonodos periféricos (PLN) ou pequenos pedaços de baço são incubadas com ou sem coquetel de enzimas para 1 hora a 37 ° C. Depois de uma hora, a expressão de antígenos é determinada por citometria de fluxo. O coquetel de enzimas não tem efeito sobre vários antígenos de superfície (Fig.2) 7. Em alguns outros casos, o tratamento enzimático resultaram em uma perda significativa de expressão antigênica. Este problema pode ser contornado utilizando marcadores de células alternativa. </li><li> Nota: coloração viabilidade Live / célula morta pode ser realizada após o passo 4, se desejar. Normalmente usam Live / Morto kit celular fixável Morto Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Para manchar as células com corante Live / Dead, criar uma solução 1x Live / Dead by acrescentando 1μl de re-dissolvido corante ao vivo / morto em 1 ml de PBS e vortex para misturar. Adicionar 100-200 mL de corante 1x Live / Dead to ao vivo / morto cocktail, solteiro, FMO e amostras de controle de isotipo. Incubar as amostras com o corante em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro. O tubo de controle único para o Live / Dead devem ser incubados a 56 ° C no escuro por 10 minutos para matar as células por choque térmico. Lavar as células com 1 ml de células da PBS e pellet por centrifugação. Resume o protocolo no passo 5. </li><li> Nota: coloração intracelular de antígenos intracelulares e citocinas é compatível com este protocolo. Resumidamente, coloração intracelular pode ser realizada utilizando a fixação de células / reagentes permeabilização da BD PharMingen, eBioscience, ou laboratórios Caltag - dependendo do antígenos de interesse. Para corrigir e permeabilizar as células para a coloração intracelular, realizar a etapa de fixação / permeabilização, seguindo as instruções do fabricante, após a etapa de coloração extracelular (seção 3 passo 5). Após a etapa de lavagem intracelular, retomar nosso protocolo na etapa 6 (passo seção 3 6). </li></ul></li></ol> 4. Análise de citometria de fluxo de isolados adventícia circundante e parede do vaso Como leucócitos podem migrar para a adventícia da aorta, assim como placas ateroscleróticas dentro da parede da aorta, para examinar os leucócitos e adventícia da aorta por citometria de fluxo de um protocolo para isolar e realizar citometria de fluxo nestes dois sítios anatômicos foi desenvolvido. 9 Em suma, antes da aortas todo são digeridos com ADES (Seção 2, etapa 2) a adventícia da aorta é parcialmente digerido e removido para o resto do navio. Uma vez que a adventícia é removida e posta de lado, o resto da aorta é digerido com ADES para libertar leucócitos da parede do vaso. <ul><li> Adventícia da aorta Isolamento Protocolo </li></ul><ol><li> Após a preparação da 1X ADES (seção 2 passo 1), prepare 2,5 ml / aorta de 1X aórtica solução enzimática digestão adventícia (AADES) (781,25 U colagenase II e 14,0625 U Elastase em 2.5mls PBS (Worthington Corp bioquímicos, Lakewood, NJ )). 9 Coloque a solução estoque em gelo até o uso. </li><li> Remover o PBS do tubo de coleta contendo a aorta. Adicionar 2,5 ml de 1X AADES a cada aorta. Não corte o aortas em pedaços pequenos. Incubar as aortas com a solução de enzima 1X adventícia por 10-20 minutos a 37 ° C. </li><li> Após a digestão 10-20 minutos, a transferência da aorta parcialmente digeridos para fora da 1X AADES a uma placa de Petri com PBS fresco. Com muito cuidado, usando dois pares de fórceps curvos, descascar a camada adventícia longe from a aorta como uma única unidade. <ul><li> Nota: Os tempos de digestão mais longos torná-lo mais fácil de remover a adventícia, entretanto, se a adventícia é over-digerida vai rasgar. </li></ul></li><li> Quando a adventícia foi completamente removido, a transferência da adventícia e da aorta para tubos separados FACS. Adicionar 1 ml de PBS para o tubo adventícia, e colocar o tubo no gelo. Adicionar 2,5 ml de 1X solução enzimática dissociação aorta ao tubo de aorta e incubar a aorta por 40 minutos a 37 ° C. <ul><li> Nota: Para facilitar a digestão enzimática, a aorta pode ser dividida em partes menores neste momento. </li></ul></li><li> Após a digestão 40 minutos, coloque o tubo de aorta no gelo e preparar suspensões única célula da aorta e adventícia pela corte as aortas e adventícia além e passá-los através de um filtro de células 70 mM em tubos de 5 ml de polipropileno FACS (BD Falcon). Agregar as células por centrifugação (400xg, a 5 minutos, 4 ° C). Voltar para seção 4 o passo 2 e retomar o protocolo. </li></ol> 5. Resultados representante Apresentamos aqui uma série de figuras que demonstra citometria de fluxo coloração para analisar a composição imune de aortas todo, a parede do vaso da aorta e da adventícia da aorta ao redor. Primeiro, nós demonstramos uma trama FACS representante que mostra uma coloração TER-119 no sangue total e suspensão de células isoladas da aorta (Fig. 1). TER-119 positivas células vermelhas do sangue responsáveis ​​por 18% das células em suspensão de células de aorta, o que indica que apenas 0,014% das células isoladas a partir de suspensões de células de aorta são derivados do sangue. Este é um experimento de controle importante que demonstra claramente que os navios digeridos, mas que não circula no sangue periférico é a fonte para a maioria dos leucócitos analisadas em suspensão de células de aorta. Além disso, para validar o método, foram avaliados os efeitos do coquetel de enzimas aorta dissociação de antígenos de superfície esplenócitos (Fig. 2). O coquetel de enzimas não tem efeitos sobre a expressão de vários antígenos, incluindo, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ e vários outros antígenos de superfície 7. CD45 coloração em conjunto com o Live / Morto corante viabilidade e controles apropriado do isotipo são usados ​​para detectar e sub-gate populações de maior interesse e para excluir restos celulares durante a análise. Na Fig.3 aórtica, ao vivo CD45 + leucócitos foram fechadas para determinar a porcentagem de células IFN Υ + T dentro do aortas conjunta de dois jovens ApoE - / - ratos. Para enfatizar a versatilidade deste método, usando o esquema apresentado na Fig.3 gating, apresentamos na Fig.4 coloração representante intracelular de CD68 + CD11b + macrófagos e IFNγ + + TCRαβ células de dois ApoE - / - ratos alimentados com dieta ocidental para 12 semanas. Como esperado, no oeste da dieta alimentar ApoE - / - aortas, a maioria dos leucócitos dentro da aorta são macrófagos (40% CD68 + CD11b +) ou de outras células mielóides (CD11b CD68 + baixa e CD11b CD68 +). Além disso, células Th1 compreendem uma maior porção da aorta se infiltrando TCRαβ células T (Fig.4). Como a percentagem global de leucócitos aórtica e subconjuntos de leucócitos varia dependendo da idade do mouse e gravidade da aterosclerose, a estratégia de propagação ideal para populações de maior interesse deve ser determinada empiricamente Para demonstrar a viabilidade de isolar adventícia da aorta para a coloração de citometria de fluxo, apresentamos representante CD45 + coloração de leucócitos para suspensões de células aórticas e adventícia (Fig. 5). Resumidamente, três com idades entre ApoE - / - aortas de rato foram digeridos e agrupados como descrito acima (Seções 2 e 4). Infiltrando CD45 + leucócitos foram detectados em ambos os adventícia (18% de suspensão de células) e restante da aorta (11% de suspensão de células). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Aorta TER-119 coloração em suspensão digerida aórtica celular. Perfundidos foi por punção cardíaca com PBS contendo heparina de 2%. Em seguida, a aorta foi digerido com o coquetel de enzimas para 1 hora a 37 ° C. Suspensão de células aórticas e amostra de sangue (como um controle positivo) foram coradas com anti-TER-119-PE Abs e analisadas por citometria de fluxo. TER-119-positivos vermelhas do sangue conta as células por 18% de todas as células em suspensão de células de aorta indicando que apenas 0,014% de todos os leucócitos isolados de aorta é provável que sejam derivados do sangue leucócitos. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Enzyme-cocktail de tratamento não tem efeitos sobre a CD45 (top) ou CD19 (baixo) expressão em linfócitos. </strong&gt; a partir de suspensões de células não tratadas (A, B) e tratados com a enzima cocktail (C, D) LN foram obtidos e corados com APC-Cy7-conjugados anti-CD45 e APC-conjugados anti-CD19 mAbs. (A, C) Os números representam as percentagens de leucócitos CD45 + no gate R1. (B, D) Os números representam a porcentagem de CD45 + / CD19 + linfócitos. Os perfis são delimitação de leucócitos CD45 +. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 Gating estratégia para a análise de leucócitos aórtica Dois aortas foram isolados e agrupados de ApoE propensas aterosclerótica -.. / - Ratos e suspensões de células de aorta foram preparadas como descrito acima. As suspensões de células foram coradas para CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), e ao vivo / morto Aqua, e analisados ​​utilizando um Cytek DXP 8 Cor atualizado BD FACS Calibur. Resumidamente, CD45 + Leucócitos foram gated (B) e depois analisados ​​(CF). Células mortas foram retiradas da análise baseada no Live / Dead coloração Aqua (D) e parcelas FSC (E). Leucócitos ao vivo aórtica foram então examinadas para TCRαβ e IFNγ expressão (F). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Suspensões de células Figura 4 coloração intracelular de antígenos intracelulares e citocinas foram preparados a partir de um conjunto ApoE - / - aorta e do baço como descrito. Aórtica (A) e suspensões de células esplênicas (B, C) foram coradas para CD45, CD11b, CD68 e ou um controle isotipo usando BD Cytofix / Cytoperm Kit ™ (BD Biosciences). Células foram fechadas em leucócitos CD45 + e detritos foi excluído com base nos perfis de dispersão para a frente e lateral. Para a coloração de IFNγ intracelular, suspensões de células aórticas e baço foram cultivados por cinco horas em RPMI 1640 suplementado com Golgi parar, PMA, e C Ionomicina, como descrito anteriormente 9. Stimulated aórtica única (D) e baço (E, F) As suspensões celulares foram posteriormente corados com CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Aqua Morto, e IFNγ (eFluor 450; E) ou um isotipo (IgG1-eF450, F). Células T (DF) foram fechadas ao vivo a partir de CD45 + CD3 + leucócitos (CD45 + Live / Aqua-Morto) e examinados para TCRαβ e IFNγ. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Figura 5"/> .. Figura 5 Imagem representativa de isolados de camundongos e adventícia da aorta parede do vaso da aorta Representante enredo citometria de fluxo contra demonstra a presença de células CD45 + T na adventícia e na parede da aorta de idade ApoE - / - ratos. SSC lado de dispersão. Para eliminar autofluorescência de detritos e tecidos necróticos, parcelas foram fechadas para FSC&gt; 750. Para evitar autofluorescência adicionais de doublets os portões foram também estabelecidas como FSC &lt;3500, SSC &lt;3500. As percentagens indicam células CD45 + nas portas.

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	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis.">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li><li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+in+atherosclerosis:+a+double-edged+sword.">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+influx+in+atherosclerosis.">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li><li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids:+a+validation+study.">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li><li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+"mock"+FL3+channel+in+flow+cytometry.">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li><li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li><li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li><li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, apresentamos um método de citometria de fluxo baseada na investigação da composição das células imunológicas de aortas de camundongos. A principal vantagem deste método é a capacidade de analisar aórtica células do sistema imunológico em uma única célula e níveis para caracterizar o status de ativação de leucócitos aórtica. Este método não é restrito a aortas de camundongos e nós (dados não publicados) e outros 10 usado essa abordagem para analisar amostras humanas, tais como art...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Número de catálogo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Colagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, tipo 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Corporação Bioquímica </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Corporação Bioquímica </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

A aterosclerose é um processo inflamatório crônico dos vasos de tamanho médio e grande porte que se caracteriza pela formação de placas consistindo em células espumosas, células imunes, vascular células endoteliais e musculares lisas, plaquetas, matriz extracelular, e um núcleo rico em lipídios, com extensa necrose e fibrose dos tecidos circundantes. Os braços uma inata e adaptativa da resposta imune estão envolvidos na iniciação, desenvolvimento e persistência da aterosclerose. 2, 3 Existe um corpo significativo de evidências de que os diversos subgrupos da células do sistema imunológico, tais como macrófagos, dendríticas células, os linfócitos T e B, estão presentes na aorta de ratos saudáveis ​​e aterosclerose propensas a 4. Além disso, as células imunológicas são encontrados na adventícia da aorta ao redor, o que sugere um papel importante deste tecido na aterogênese 2. Por algum tempo, a detecção quantitativa de diferentes tipos de células do sistema imunológico, o seu estado de ativação e da composição celular dentro da parede da aorta foi limitado pela RT-PCR e métodos de imuno-histoquímica para o estudo da aterosclerose. Foram feitas algumas tentativas para executar a citometria de fluxo utilizando aortas humanas, e uma série de problemas, como um autofluorescência alta, têm sido relatados 5,6. Humana placas ateroscleróticas foram digeridos com colagenase 1 e células livres foram coletadas e coradas para CD14 + / CD11c + para realçar as células de macrófagos derivados de espuma. Neste estudo, um canal de &quot;mock&quot; foi usado para evitar falsos-positivos de coloração. 6 materiais Necrotic acumulando durante o processo de digestão dar origem em uma grande quantidade de detritos que gera uma alta autofluorescência em amostras da aorta. Para resolver esse problema, um painel de controles negativo e positivo tem sido proposto, mas apenas a coloração dupla pode ser aplicado nessas amostras. Nós desenvolvemos um novo método de citometria de fluxo baseado em 7 a analisar a composição das células imunológicas e caracterizar a ativação, proliferação, diferenciação de células do sistema imunológico em aorta saudável e propenso a aterosclerose. Este método permite a investigação da composição das células imunológicas da parede da aorta e abre possibilidades de usar um amplo espectro de métodos imunológicos para investigação de aspectos imunológicos da doença.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Research

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Immunology and Infection

34.4K visualizações.  Eastern Virginia Medical School. Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Medir a atividade das calpaínas em células fixas e Vivendo por citometria de fluxo

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Imunologia e Infecção

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Isolamento de citometria de fluxo de células primárias Murino Tipo II epiteliais alveolares de Estudos funcionais e Molecular

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Discrimination of Seven Immune Cell Subsets by Two-fluorochrome Flow Cytometry

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. Setup of a classic multicolor panel requires high-end instruments, custom labeled antibodies, and careful study design to minimize spectral overlap. We developed a multiparametric analysis to identify major human immune populations (CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes) in peripheral blood by combining seven lineage markers using only two fluorochromes. Our strategy is based on the observation that lineage markers are constantly expressed in a unique combination by each cell population. Combining this information with a careful titration of the antibodies allows investigators to record five additional markers, expanding the optical limit of most flow cytometers. Head-to-head comparison demonstrated that the vast majority of immune cell populations in peripheral blood can be characterized with comparable accuracy between our method and the classic &#34;one fluorochrome-one marker approach&#34;, although the latter is still more precise for identifying populations such as NKT cells and &#947;&#948; T cells. Combining seven markers using two fluorochromes allows for the analysis of complex immune cell populations and clinical samples on affordable 6-10 fluorochrome flow cytometers, and even on 2-3 fluorochrome field instruments in areas with limited resources. High-end instruments can also benefit from this approach by using extra fluorochromes to accomplish deeper flow cytometry analysis. This approach is also very well suited for screening several cell populations in the case of clinical samples with limited number of cells.

Here, we present a flow cytometric protocol to identify CD4+ and CD8+ T cells, &#947;&#948; T cells, B cells, NK cells and monocytes in human peripheral blood by using only two fluorochromes instead of seven. With this approach, five additional markers can be recorded on most flow cytometers.

Discriminação de sete subconjuntos de células imunes por dois-fluorocromo citometria de fluxo

Immune cell characterization heavily relies on multicolor flow cytometry to identify subpopulations based on differential expression of surface markers. ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparação de medula óssea inteira para análise de citometria de massa de células de linhagem de neutrófilos

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Isolamento das células CD8+ T residentes em rim do rato para análise de citometria de fluxo

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

Análise da Restrição de SAMHD1 por Citometria de Fluxo em Células U937 Mieloides Humanas

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...