Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção: PO1 HL55798 (para KL) e American Heart Association Scientist Desenvolvimento Grant 0525532U (para EG).

1. Isolamento de aortas de camundongos Aprovação do comitê institucional IACUC do procedimento é necessário para trabalhar com camundongos. <ol><li> Prepare heparinzed PBS, acrescentando 1.000 unidades de heparina sódica a 50 ml de PBS e invertendo o tubo para misturar. Prepare um tubo de coleta vazio para o sangue e um tubo de coleta contendo PBS para cada aorta a ser coletado. Manter todos os tubos no gelo. </li><li> Heparinizar uma seringa de sangue de desenho (0,1 ml de Heparina sódica 1.000 U / ml), prepare instrumentos cirúrgicos (dois pares de fórceps curvado, um par de tesouras de dissecação, e um par de microshears), e um estágio de dissecação para a dissecção. </li><li> Euthanize um rato usando dióxido de carbono em uma câmara aprovou seguintes NIH e Institucional políticas comitê IACUC sobre a eutanásia de roedores. Verificar a eficácia antes de transferir o mouse para o estágio de dissecação. </li><li> Brevemente absorver o mouse com etanol 70% e apertar o mouse para o estágio de dissecação. Tirar sangue do rato através de punção cardíaca. </li><li> Abra as cavidades abdominal e torácica. Usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 25 g, completamente perfundir a vasculatura com PBS contendo 2% de heparina para remover completamente sangue dos vasos por punção cardíaca. Certifique-se que não há sangue dentro dos tecidos da aorta. A perfusão deve ser realizada lentamente, com pouca pressão para garantir que todas as placas na parede dos vasos permanecem intactos. </li><li> Dissecar e remover os órgãos viscerais, órgãos geniturinários, o diafragma eo baço, deixando os rins, coração, aorta e intacta. </li><li> Dissecar cuidadosamente os tecidos adiposo e nós linfáticos para-aórticos longe da aorta, deixando a aorta e adventícia intacta. Recolher toda a aorta, incluindo arco aórtico, ascendente, descendente, torácica, abdominal e porções. Coloque a aorta isolada em um tubo de coleta com PBS. Durante o procedimento de isolamento, tente manter a umidade do vaso. </li></ol> 2. Preparação de suspensões única célula <ol><li> Criar uma 1X Aorta dissociação Solução estoque de enzimas (ADES) (125 U / ml de colagenase tipo XI, 60 do tipo U / ml Hialuronidase 1-s, 60 U / ml DNase I, e 450 U / ml de colagenase tipo I, em 2,5 ml de PBS, modificado a partir Galkina et al. 7). Todas as enzimas são da Sigma-Aldrich. Coloque a solução enzimática de ações no gelo. </li><li> Remover o PBS do tubo de coleta contendo a aorta. Adicionar 2,5 ml de 1X ADES a cada aorta. Corte o aortas em pedaços pequenos para facilitar a digestão enzimática ou deixar toda a aorta intacta. Incubar as aortas com a solução de enzima 1X por 1 hora a 37 ° C (mais lenta agitação é opcional). </li><li> Após a incubação de 1 hora, preparar suspensões única célula da aorta digerido pelo corte as aortas além e passá-los através de um filtro de células 70 mM em tubos de 5 ml de polipropileno FACS (BD Falcon). Agregar as células por centrifugação (400xg, a 5 minutos, 4 ° C). </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de tampão FACS (PBS suplementado com BSA 1% e 0,05% NaN 3) e determinar quantas células estão presentes na suspensão celular aórtica usando azul de tripano, um hemocitômetro, e um microscópio de luz. O número total de células obtidas após a digestão vai depender da idade do mouse e dieta ou a gravidade da aterosclerose. </li></ol> 3. Coloração citometria de fluxo <ol><li> Rotular um número apropriado de sondas novas FACS. Em geral, os experimentos de citometria de fluxo deve ter um tubo de controle não-manchado, conjunto de tubos de cor única, apropriada fluorescência-menos-um controles (FMO) 8, controles isotipo apropriado, e um conjunto de tubos experimental. Uma vez que há um número limitado de leucócitos aórtica que podem ser isoladas, os leucócitos do baço pode ser usado para executar a coloração único controle. </li><li> Nós usamos um protocolo de citometria de fluxo padrão para manchar suspensões de células de aorta. Resumidamente, a transferência de uma alíquota de 0,5-1x10 6 células de uma suspensão de células de aorta em um tubo FACS (s). Adicionar 1 ml de tampão FACS e agregar as células por centrifugação. Retire o sobrenadante das células peletizada por decantação. </li><li> Prepare Fc solução bloco e cocktails de anticorpos para os tubos experimental, de fluorescência-menos-um tubos e tubos de isotipo. Adicionar 100μl de Fc bloco na FACS buffer (14.2μg/ml, clone 2.4G2) para todos os tubos e agite suavemente dedo ou vortex para ressuspender as células. Incubar as amostras por 15-20 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Prepare coloração de anticorpos, coloração isotipo ou cocktails coloração FMO controle. Determinar a concentração ideal de anticorpos em seus experimentos de titulação preliminar. Na presença de bloqueio de Fc, adicione cocktails de anticorpos (100ul/0.5-1.0x10 6 células) para os tubos de amostra. Incubar por 20-30 min a 4 ° C no escuro. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão FACS a cada tubo, vortex para misturar e agregar as células por centrifugação. Repita o procedimento mais uma vez. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspenderas células peletizadas em 300 ul de PFA 2%. Executar os exemplos em um citômetro de fluxo. <ul><li> Nota: Normalmente anticorpo anti-CD45 (marcador de antígeno leucocitário comum) é adicionado a todas as amostras, a fim de portão CD45 + leucócitos depois 7 Além disso, CD45 FMO e controles isotipo deve ser usado inicialmente para colocar o portão CD45 + leucócitos como. CD45 expressão pode variar entre os leucócitos. </li><li> Nota: Para detectar baixa densidade expressar antígenos de superfície ou antígenos evento baixo, use &quot;fluorocromos brilhante&quot; como o R-Ficoeritrina (PE) ou Allophycocyanin (APC). Além disso, eventos raros pode ser detectado por vários pooling aortas combinados juntos, no entanto, se mais de um milhão de células são usadas, a quantidade de anticorpos utilizados para ensaio deve ser aumentado proporcionalmente. </li><li> Nota: Para garantir que não há contaminação de sangue mínima nas aortas isoladas e, consequentemente, a suspensão de células de aorta, em alguns experimentos coloração adicional foi realizada para TER-119, 7 um antígeno expresso por células vermelhas do sangue (RBC). O número de RBC para as células brancas do sangue (WBC) no sangue é de aproximadamente 10x10 6 células / mL para células 8x10 3 / mL. Com base na expressão do TER-119 em amostras de aorta, o percentual de derivados do sangue glóbulos brancos do sangue na amostra pode ser calculada. Normalmente temos menos de 0,02% de derivados do sangue WBC em amostras da aorta. (Fig.1) </li><li> Nota: Como o tratamento enzimático pode afetar a expressão dos antígenos de superfície, a resistência à digestão enzimática deve ser determinada para os antígenos de interesse. Resumidamente, linfonodos periféricos (PLN) ou pequenos pedaços de baço são incubadas com ou sem coquetel de enzimas para 1 hora a 37 ° C. Depois de uma hora, a expressão de antígenos é determinada por citometria de fluxo. O coquetel de enzimas não tem efeito sobre vários antígenos de superfície (Fig.2) 7. Em alguns outros casos, o tratamento enzimático resultaram em uma perda significativa de expressão antigênica. Este problema pode ser contornado utilizando marcadores de células alternativa. </li><li> Nota: coloração viabilidade Live / célula morta pode ser realizada após o passo 4, se desejar. Normalmente usam Live / Morto kit celular fixável Morto Stain (Invitrogen, Molecular Probes). Para manchar as células com corante Live / Dead, criar uma solução 1x Live / Dead by acrescentando 1μl de re-dissolvido corante ao vivo / morto em 1 ml de PBS e vortex para misturar. Adicionar 100-200 mL de corante 1x Live / Dead to ao vivo / morto cocktail, solteiro, FMO e amostras de controle de isotipo. Incubar as amostras com o corante em temperatura ambiente por 10 minutos no escuro. O tubo de controle único para o Live / Dead devem ser incubados a 56 ° C no escuro por 10 minutos para matar as células por choque térmico. Lavar as células com 1 ml de células da PBS e pellet por centrifugação. Resume o protocolo no passo 5. </li><li> Nota: coloração intracelular de antígenos intracelulares e citocinas é compatível com este protocolo. Resumidamente, coloração intracelular pode ser realizada utilizando a fixação de células / reagentes permeabilização da BD PharMingen, eBioscience, ou laboratórios Caltag - dependendo do antígenos de interesse. Para corrigir e permeabilizar as células para a coloração intracelular, realizar a etapa de fixação / permeabilização, seguindo as instruções do fabricante, após a etapa de coloração extracelular (seção 3 passo 5). Após a etapa de lavagem intracelular, retomar nosso protocolo na etapa 6 (passo seção 3 6). </li></ul></li></ol> 4. Análise de citometria de fluxo de isolados adventícia circundante e parede do vaso Como leucócitos podem migrar para a adventícia da aorta, assim como placas ateroscleróticas dentro da parede da aorta, para examinar os leucócitos e adventícia da aorta por citometria de fluxo de um protocolo para isolar e realizar citometria de fluxo nestes dois sítios anatômicos foi desenvolvido. 9 Em suma, antes da aortas todo são digeridos com ADES (Seção 2, etapa 2) a adventícia da aorta é parcialmente digerido e removido para o resto do navio. Uma vez que a adventícia é removida e posta de lado, o resto da aorta é digerido com ADES para libertar leucócitos da parede do vaso. <ul><li> Adventícia da aorta Isolamento Protocolo </li></ul><ol><li> Após a preparação da 1X ADES (seção 2 passo 1), prepare 2,5 ml / aorta de 1X aórtica solução enzimática digestão adventícia (AADES) (781,25 U colagenase II e 14,0625 U Elastase em 2.5mls PBS (Worthington Corp bioquímicos, Lakewood, NJ )). 9 Coloque a solução estoque em gelo até o uso. </li><li> Remover o PBS do tubo de coleta contendo a aorta. Adicionar 2,5 ml de 1X AADES a cada aorta. Não corte o aortas em pedaços pequenos. Incubar as aortas com a solução de enzima 1X adventícia por 10-20 minutos a 37 ° C. </li><li> Após a digestão 10-20 minutos, a transferência da aorta parcialmente digeridos para fora da 1X AADES a uma placa de Petri com PBS fresco. Com muito cuidado, usando dois pares de fórceps curvos, descascar a camada adventícia longe from a aorta como uma única unidade. <ul><li> Nota: Os tempos de digestão mais longos torná-lo mais fácil de remover a adventícia, entretanto, se a adventícia é over-digerida vai rasgar. </li></ul></li><li> Quando a adventícia foi completamente removido, a transferência da adventícia e da aorta para tubos separados FACS. Adicionar 1 ml de PBS para o tubo adventícia, e colocar o tubo no gelo. Adicionar 2,5 ml de 1X solução enzimática dissociação aorta ao tubo de aorta e incubar a aorta por 40 minutos a 37 ° C. <ul><li> Nota: Para facilitar a digestão enzimática, a aorta pode ser dividida em partes menores neste momento. </li></ul></li><li> Após a digestão 40 minutos, coloque o tubo de aorta no gelo e preparar suspensões única célula da aorta e adventícia pela corte as aortas e adventícia além e passá-los através de um filtro de células 70 mM em tubos de 5 ml de polipropileno FACS (BD Falcon). Agregar as células por centrifugação (400xg, a 5 minutos, 4 ° C). Voltar para seção 4 o passo 2 e retomar o protocolo. </li></ol> 5. Resultados representante Apresentamos aqui uma série de figuras que demonstra citometria de fluxo coloração para analisar a composição imune de aortas todo, a parede do vaso da aorta e da adventícia da aorta ao redor. Primeiro, nós demonstramos uma trama FACS representante que mostra uma coloração TER-119 no sangue total e suspensão de células isoladas da aorta (Fig. 1). TER-119 positivas células vermelhas do sangue responsáveis ​​por 18% das células em suspensão de células de aorta, o que indica que apenas 0,014% das células isoladas a partir de suspensões de células de aorta são derivados do sangue. Este é um experimento de controle importante que demonstra claramente que os navios digeridos, mas que não circula no sangue periférico é a fonte para a maioria dos leucócitos analisadas em suspensão de células de aorta. Além disso, para validar o método, foram avaliados os efeitos do coquetel de enzimas aorta dissociação de antígenos de superfície esplenócitos (Fig. 2). O coquetel de enzimas não tem efeitos sobre a expressão de vários antígenos, incluindo, CD45, CD19, CD3, TCRαβ, TCRγδ e vários outros antígenos de superfície 7. CD45 coloração em conjunto com o Live / Morto corante viabilidade e controles apropriado do isotipo são usados ​​para detectar e sub-gate populações de maior interesse e para excluir restos celulares durante a análise. Na Fig.3 aórtica, ao vivo CD45 + leucócitos foram fechadas para determinar a porcentagem de células IFN Υ + T dentro do aortas conjunta de dois jovens ApoE - / - ratos. Para enfatizar a versatilidade deste método, usando o esquema apresentado na Fig.3 gating, apresentamos na Fig.4 coloração representante intracelular de CD68 + CD11b + macrófagos e IFNγ + + TCRαβ células de dois ApoE - / - ratos alimentados com dieta ocidental para 12 semanas. Como esperado, no oeste da dieta alimentar ApoE - / - aortas, a maioria dos leucócitos dentro da aorta são macrófagos (40% CD68 + CD11b +) ou de outras células mielóides (CD11b CD68 + baixa e CD11b CD68 +). Além disso, células Th1 compreendem uma maior porção da aorta se infiltrando TCRαβ células T (Fig.4). Como a percentagem global de leucócitos aórtica e subconjuntos de leucócitos varia dependendo da idade do mouse e gravidade da aterosclerose, a estratégia de propagação ideal para populações de maior interesse deve ser determinada empiricamente Para demonstrar a viabilidade de isolar adventícia da aorta para a coloração de citometria de fluxo, apresentamos representante CD45 + coloração de leucócitos para suspensões de células aórticas e adventícia (Fig. 5). Resumidamente, três com idades entre ApoE - / - aortas de rato foram digeridos e agrupados como descrito acima (Seções 2 e 4). Infiltrando CD45 + leucócitos foram detectados em ambos os adventícia (18% de suspensão de células) e restante da aorta (11% de suspensão de células). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Aorta TER-119 coloração em suspensão digerida aórtica celular. Perfundidos foi por punção cardíaca com PBS contendo heparina de 2%. Em seguida, a aorta foi digerido com o coquetel de enzimas para 1 hora a 37 ° C. Suspensão de células aórticas e amostra de sangue (como um controle positivo) foram coradas com anti-TER-119-PE Abs e analisadas por citometria de fluxo. TER-119-positivos vermelhas do sangue conta as células por 18% de todas as células em suspensão de células de aorta indicando que apenas 0,014% de todos os leucócitos isolados de aorta é provável que sejam derivados do sangue leucócitos. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Enzyme-cocktail de tratamento não tem efeitos sobre a CD45 (top) ou CD19 (baixo) expressão em linfócitos. </strong&gt; a partir de suspensões de células não tratadas (A, B) e tratados com a enzima cocktail (C, D) LN foram obtidos e corados com APC-Cy7-conjugados anti-CD45 e APC-conjugados anti-CD19 mAbs. (A, C) Os números representam as percentagens de leucócitos CD45 + no gate R1. (B, D) Os números representam a porcentagem de CD45 + / CD19 + linfócitos. Os perfis são delimitação de leucócitos CD45 +. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3 Gating estratégia para a análise de leucócitos aórtica Dois aortas foram isolados e agrupados de ApoE propensas aterosclerótica -.. / - Ratos e suspensões de células de aorta foram preparadas como descrito acima. As suspensões de células foram coradas para CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), IFNγ (eFluor 450), e ao vivo / morto Aqua, e analisados ​​utilizando um Cytek DXP 8 Cor atualizado BD FACS Calibur. Resumidamente, CD45 + Leucócitos foram gated (B) e depois analisados ​​(CF). Células mortas foram retiradas da análise baseada no Live / Dead coloração Aqua (D) e parcelas FSC (E). Leucócitos ao vivo aórtica foram então examinadas para TCRαβ e IFNγ expressão (F). <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig4.jpg" alt="Figura 4"/> .. Suspensões de células Figura 4 coloração intracelular de antígenos intracelulares e citocinas foram preparados a partir de um conjunto ApoE - / - aorta e do baço como descrito. Aórtica (A) e suspensões de células esplênicas (B, C) foram coradas para CD45, CD11b, CD68 e ou um controle isotipo usando BD Cytofix / Cytoperm Kit ™ (BD Biosciences). Células foram fechadas em leucócitos CD45 + e detritos foi excluído com base nos perfis de dispersão para a frente e lateral. Para a coloração de IFNγ intracelular, suspensões de células aórticas e baço foram cultivados por cinco horas em RPMI 1640 suplementado com Golgi parar, PMA, e C Ionomicina, como descrito anteriormente 9. Stimulated aórtica única (D) e baço (E, F) As suspensões celulares foram posteriormente corados com CD45 (PerCP), TCRαβ (FITC), CD3 (APC-Cy7), Live Aqua Morto, e IFNγ (eFluor 450; E) ou um isotipo (IgG1-eF450, F). Células T (DF) foram fechadas ao vivo a partir de CD45 + CD3 + leucócitos (CD45 + Live / Aqua-Morto) e examinados para TCRαβ e IFNγ. <img src="/files/ftp_upload/2848/2848fig5.jpg" alt="Figura 5"/> .. Figura 5 Imagem representativa de isolados de camundongos e adventícia da aorta parede do vaso da aorta Representante enredo citometria de fluxo contra demonstra a presença de células CD45 + T na adventícia e na parede da aorta de idade ApoE - / - ratos. SSC lado de dispersão. Para eliminar autofluorescência de detritos e tecidos necróticos, parcelas foram fechadas para FSC&gt; 750. Para evitar autofluorescência adicionais de doublets os portões foram também estabelecidas como FSC &lt;3500, SSC &lt;3500. As percentagens indicam células CD45 + nas portas.

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	<li>Lusis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-2341 (2000).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+and+inflammatory+mechanisms+of+atherosclerosis.">Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis.</a> Annu Rev Immunol. 27, 165-197 (2009).</li><li>Hansson, G. K., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+in+atherosclerosis:+a+double-edged+sword.">The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword.</a> Nat Rev Immunol. 6, 508-519 (2006).</li><li>Galkina, E., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+influx+in+atherosclerosis.">Leukocyte influx in atherosclerosis.</a> Curr Drug Targets. 812, 1239-1248 (2007).</li><li>Bonanno, E., Mauriello, A., Partenzi, A., Anemona, L., Spagnoli, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+analysis+of+atherosclerotic+plaque+cells+from+human+carotids:+a+validation+study.">Flow cytometry analysis of atherosclerotic plaque cells from human carotids: a validation study.</a> Cytometry. 39, 158-165 (2000).</li><li>Liu-Wu, Y., Svenningsson, A., Stemme, S., Holm, J., Wiklund, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+analysis+of+macrophage-derived+foam+cells+from+human+atherosclerotic+lesions+by+using+a+"mock"+FL3+channel+in+flow+cytometry.">Identification and analysis of macrophage-derived foam cells from human atherosclerotic lesions by using a "mock" FL3 channel in flow cytometry.</a> Cytometry. 29, 155-164 (1997).</li><li>Galkina, E., Kadl, A., Sanders, J., Varughese, D., Sarembock, I. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent.">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> J Exp Med. 203, 1273-1282 (2006).</li><li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data.">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li><li>Smith, E., Prasad, K. M., Butcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+interleukin-17A+results+in+reduced+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice.">Blockade of interleukin-17A results in reduced atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.</a> Circulation. 121, 1746-1755 (2010).</li><li>Eid, R. E., Rao, D. A., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-17+and+interferon-gamma+are+produced+concomitantly+by+human+coronary+artery-infiltrating+T+cells+and+act+synergistically+on+vascular+smooth+muscle+cells.">Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells.</a> Circulation. 119, 1424-1432 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Aqui, apresentamos um método de citometria de fluxo baseada na investigação da composição das células imunológicas de aortas de camundongos. A principal vantagem deste método é a capacidade de analisar aórtica células do sistema imunológico em uma única célula e níveis para caracterizar o status de ativação de leucócitos aórtica. Este método não é restrito a aortas de camundongos e nós (dados não publicados) e outros 10 usado essa abordagem para analisar amostras humanas, tais como art...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material </td><td> Número de catálogo </td><td> Companhia </td></tr><tr><td> Colagenase XI </td><td> C7657 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> H3506 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> DNase I, tipo 2 </td><td> D4527 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenase I </td><td> C0130 </td><td> Sigma-Aldrich </td></tr><tr><td> Colagenase II </td><td> LS004174 </td><td> Worthington Corporação Bioquímica </td></tr><tr><td> Elastase </td><td> LS002292 </td><td> Worthington Corporação Bioquímica </td></tr></tbody></table>

flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas

A aterosclerose é um processo inflamatório crônico dos vasos de tamanho médio e grande porte que se caracteriza pela formação de placas consistindo em células espumosas, células imunes, vascular células endoteliais e musculares lisas, plaquetas, matriz extracelular, e um núcleo rico em lipídios, com extensa necrose e fibrose dos tecidos circundantes. Os braços uma inata e adaptativa da resposta imune estão envolvidos na iniciação, desenvolvimento e persistência da aterosclerose. 2, 3 Existe um corpo significativo de evidências de que os diversos subgrupos da células do sistema imunológico, tais como macrófagos, dendríticas células, os linfócitos T e B, estão presentes na aorta de ratos saudáveis ​​e aterosclerose propensas a 4. Além disso, as células imunológicas são encontrados na adventícia da aorta ao redor, o que sugere um papel importante deste tecido na aterogênese 2. Por algum tempo, a detecção quantitativa de diferentes tipos de células do sistema imunológico, o seu estado de ativação e da composição celular dentro da parede da aorta foi limitado pela RT-PCR e métodos de imuno-histoquímica para o estudo da aterosclerose. Foram feitas algumas tentativas para executar a citometria de fluxo utilizando aortas humanas, e uma série de problemas, como um autofluorescência alta, têm sido relatados 5,6. Humana placas ateroscleróticas foram digeridos com colagenase 1 e células livres foram coletadas e coradas para CD14 + / CD11c + para realçar as células de macrófagos derivados de espuma. Neste estudo, um canal de &quot;mock&quot; foi usado para evitar falsos-positivos de coloração. 6 materiais Necrotic acumulando durante o processo de digestão dar origem em uma grande quantidade de detritos que gera uma alta autofluorescência em amostras da aorta. Para resolver esse problema, um painel de controles negativo e positivo tem sido proposto, mas apenas a coloração dupla pode ser aplicado nessas amostras. Nós desenvolvemos um novo método de citometria de fluxo baseado em 7 a analisar a composição das células imunológicas e caracterizar a ativação, proliferação, diferenciação de células do sistema imunológico em aorta saudável e propenso a aterosclerose. Este método permite a investigação da composição das células imunológicas da parede da aorta e abre possibilidades de usar um amplo espectro de métodos imunológicos para investigação de aspectos imunológicos da doença.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

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Immunology and Infection

34.3K visualizações.  Eastern Virginia Medical School. Este trabalho apresenta um método de citometria de fluxo baseado em investigar a composição imune de aortas. O documento também ilustra uma técnica adicional que permite examinar adventícia circundante e parede do vaso separadamente. Esse método abre possibilidades para realizar análises fenotípica de leucócitos aórtica e aplicar vários ensaios imunológicos para estudos de aterosclerose.