Name: piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice
Uploaded: 2018-03-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
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Tamara Zeric para ajudar a obter a imagem do multiphoton neste trabalho. Suportado pelo cérebro & comportamento, Parkinson e fundações JPB, R01 MH108186 e R01 DA07418. F31 comunhão 1F31MH109293-01A1 S c.

Todos os procedimentos que envolvem animais foram realizados de acordo com as normas definidas pela Columbia University Medical Center institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). A eutanásia foi realizada através de deslocamento cervical sob anestesia com cetamina 100mg/kg e xilazina 10 mg/kg, injetados intraperitonealmente. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados de forma estéril (cirurgião estava usando tampão principal, máscara, luvas estéreis e jaleco descartável limpo) e instrumentos cirúrgicos foram esterilizados entre cada uso.
1. pré-operatória passos
<ol><li>Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos para garantir a esterilidade.</li>
	<li>ANESTHETIZE camundongos C57bl6 com isoflurano (4% para a indução e 1,5-2% para a cirurgia). Aperte o dedo do pé traseiro cada 10 min para assegurar adequada profundidade da anestesia. Aumente a anestesia se vocalização ou membro posterior retração é vista.</li>
	<li>Aplique lubrificante veterinária olho para os olhos para impedir a secagem.</li>
	<li>Remova o cabelo sobre o couro cabeludo com um aplicativo de 3 min de gel de remoção de cabelo ou fazer a barba com um barbeador elétrico.</li>
	<li>Posicione o mouse no quadro estereotáxica em uma almofada de aquecimento ou cobertor de recirculação de água calibrado conjunto de 38° C.</li>
	<li>Administre a buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para fornecer analgesia pré-operatória.</li>
	<li>Desinfecte o couro cabeludo com três aplicações alternadas de clorexidina ou betadine e etanol 70% usando um aplicador de ponta de algodão.</li>
	<li>Injete 100ml de 50% de bupivacaína diluída em soro fisiológico sob o couro cabeludo para fornecer anestesia local.</li>
</ol>2. piezoelétrico janela craniana cirurgia
<ol><li>Utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis autoclavados, remova um círculo de 1 cm do couro cabeludo sobre o crânio, corte com tesoura cirúrgica em um padrão circular. Levante o couro cabeludo fora do crânio, expondo o tecido periósteo sobre o osso.</li>
	<li>Use a ponta da pinça para raspar o osso exposto claro de qualquer tecido restante do periósteo. Isto é importante para garantir que o cimento dental não cairá mais tarde.</li>
	<li>Defina a unidade de cirurgia piezoeléctrica a vibrar na configuração mais baixa. Observe que definições mais elevadas podem quebrar vasos sanguíneos devido a vibrações intensas.</li>
	<li>Corrigi a ponta circular estéril à peça de mão. Nota: A ponta circular de 4mm é bem adequada para cirurgias. O tamanho da ponta grande contribui para a velocidade da cirurgia, como a janela inteira pode ser diluída em simultâneo.</li>
	<li>Encher uma seringa de 10 mL com gelo frio artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) e segure na mão não segurando o handpiece piezoelétrico.</li>
	<li>Irrigar o crânio por gotejamento a ACSF da seringa para o crânio em uma taxa de 1 mL/min. como alternativa, usar uma bomba peristáltica, posicionada sobre o crânio para liberar o uso da outra mão. Nota: Irrigação com ACSF frio é importante para evitar o sobreaquecimento devido a fricção das vibrações de alta frequência.</li>
	<li>Aplicar suavemente a ponta vibratória cirúrgica no crânio com um leve movimento circular (3 círculos por 1 s) e fina do osso para a profundidade desejada para realizar uma preparação de crânio fina (5 a 10 min). Nota: Aqui, windows 4 mm foram feitas que foram diluídos a 20 µm. No entanto, o tamanho da janela irá variar com o tamanho da ponta cirúrgica. A espessura do osso pode ser ajustada para a profundidade desejada, com base no comprimento de tempo gastado aplicando a ponta no crânio.</li>
	<li>Delicadamente, ajustar o ângulo da peça de mão e mudar o ângulo da ponta e aplicando pressão no crânio para diluir o crânio uniformemente.</li>
	<li>Para executar uma remoção óssea completa sem deixar qualquer osso fino atrás, fina do osso até rachaduras são visíveis ao redor da área de janela. Retire os flocos restantes do osso fino com pinça sem danificar a dura-máter subjacente.</li>
	<li>Mergulhe um pedaço de 1 mm de espuma de colágeno hemostático em ACSF frio. Segure a espuma molhada com pinça e coloque-o sobre o crânio fino. Deixe-o sentar-se no crânio fino por cerca de 30 s para parar qualquer micro sangramentos de se desenvolver.</li>
	<li>Use fórceps para colocar uma lamela de vidro de 4 mm lateralmente sobre a janela que diluiu-se dentro do osso.</li>
	<li>Use as costas de um pequeno algodão plástico ou de madeira com ponta aplicadora para aplicar aproximadamente 100 µ l de acrílico dental no crânio para segurar a janela no lugar.</li>
</ol>3. pós-cirúrgico cuidados
<ol><li>Remova o mouse do aparelho cirúrgico e colocá-lo em uma gaiola aquecida para recuperação. Monitorá-lo continuamente até que recuperou a consciência cheia (avaliada pelo comportamento da marcha e mobilidade normal).</li>
	<li>Avalie os animais duas vezes por dia por três dias para manifestações de dor pós-cirúrgica, incluindo a diminuição da atividade, aparar, comida e o consumo de água, guardando o comportamento (por exemplo, mancando ou uma postura encurvada) ou aumento da agressão. Não retornam o animal para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.</li>
	<li>Administrar a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico 8 – 12 h após a cirurgia, durante 3 dias. Monitore a área da janela de perto após a cirurgia para sinais de infecção, inflamação e deiscência. Se o animal não retornar à linha de base, alimentação e comportamentos de aliciamento, consulte um veterinário sobre possíveis intervenções ou eutanásia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).</li><li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long+term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice.">Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat protoc. 12, 213-220 (2010).</li><li>Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+intravital+thinned+skull+and+cranial+window+approaches+to+study+CNS+immunobiology+in+the+mouse+cortex.">Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex.</a> Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).</li><li>Drew, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+optical+access+through+a+polished+and+reinforced+thinned+skull.">Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull.</a> Nat Methods. 7, 981-984 (2010).</li><li>Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+transparent+cranial+window+based+on+skull+optical+clearing.">An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing.</a> Laser Physics Letters. 9, (2012).</li><li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skull+Optical+Clearing+Solution+for+Enhancing+Ultrasonic+and+Photoacoustic+Imaging.">Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging.</a> IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).</li><li>Vercellotti, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+in+implantology:+a+case+report--a+new+piezoelectric+ridge+expansion+technique.">Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).</li><li>Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+piezoelectric+bony+window+osteotomy+and+sinus+membrane+elevation:+introduction+of+a+new+technique+for+simplification+of+the+sinus+augmentation+procedure.">The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).</li><li>Vercellotti, T., Podesta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthodontic+microsurgery:+a+new+surgically+guided+technique+for+dental+movement.">Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).</li><li>Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+in+implant+dentistry.">Piezoelectric surgery in implant dentistry.</a> Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).</li><li>Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Study+of+Piezoelectric+and+Rotary+Osteotomy+Technique+for+Third+Molar+Impaction.">Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction.</a> J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).</li><li>Pavlikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Piezoelectric+surgery+prevents+brain+tissue+damage:+an+experimental+study+on+a+new+rat+model.">Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model.</a> Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).</li></ol>

Não há nenhum divulgações.

A cirurgia pode ser modificada alterando a ponta cirúrgica. Há muitos tamanhos diferentes de ponta que pode ser aplicado à peça de mão. Alterar o tamanho ou a forma da ponta resultará em janelas de tamanhos diferentes. Além da ponta de 4mm, também tentei uma dica de 3 mm e encontrado também funcionou bem. Mesmo com a irrigação com gelo frio ACSF, não fomos capazes de obter bons resultados com dicas que foram muito estreito (cerca de 0,25 mm) devido as vibrações concentradas, causando muito calor e queima o osso, levando a danos para a dura-máter subjacente. Nós não tentamos a multidão de outras dicas que estão disponíveis, e esperamos que outros laboratórios podem encontrar novas aplicações para estas pontas diferentes. Enquanto a cirurgia é relativamente simples, achamos que há várias etapas que podem exigir a resolução de problemas. O primeiro é que a ponta vibratória produz muita turbulência na ACSF, que diminui a visibilidade e produz dificuldade em determinar a profundidade de osso durante o osso desbaste etapa da cirurgia. Recomendamos que, se é muito difícil de ver como o osso é magro, fazer uma pausa para secar o crânio e a janela aplicando um cotonete estéril para o lado do osso. Não se aplica o cotonete diretamente para a janela, desde que a superfície áspera é prejudicial para o osso fino. Depois de verificar a profundidade, reaplique ACSF e continuar com a cirurgia. Também achamos que se não há danos para a dura-máter, é geralmente devido ao cirurgião colocar muita pressão na ponta. Segurando a peça de mão mais suavemente e aplicando menos força provavelmente irão corrigir este problema. Se o cirurgião é forçosamente raspando a dica sobre o osso, vai causar uma ruptura no osso fino e danificar o crânio. Finalmente, após a diluição do osso, a dura-máter subjacente aparece ferida, se devido ao calor em excesso de vibrações. Aumentando a taxa de fluxo ACSF vai resolver este problema.
A principal limitação do FASOR é que a peça de mão pode diluir o osso, mas não é possível remover todo o osso sobre a dura-máter. A ponta de diamante revestido tem pequenas saliências ásperas. O atrito necessário para "afinar" o crânio que abrada a dura-máter e causar sangramento se fosse usado para remover todo o osso. Assim, o uso de fórceps é necessário para remover a restante camada fina. Enquanto há um debate em curso sobre se a imagem através de um crânio fina produz menos inflamação e menos proliferação da microglia e astrócitos reativos, em alguns casos uma janela com nenhum osso remanescente é o preferido, por exemplo, para fornecer uma maior profundidade de imagem3 .
Otimizamos a preparação de janela cranial para a imagem latente do multiphoton em camundongos. FASOR é, a nosso conhecimento, a primeira aplicação da técnica piezoelétrica para cirurgia de roedores janela cranial para a imagem latente ótica. Descobrimos que o uso de cirurgia piezoeléctrica em camundongos compartilha as vantagens do aumento da velocidade e diminuição de eventos adversos relatados também em seres humanos7,8,9,10. Utilização do dispositivo piezoelétrico resultou em cirurgias mais rápidas (Figura 2A) e menos eventos adversos de sangramento quando comparado com uma giratória de alta velocidade da broca (Figura 2B). Também encontramos, no nosso laboratório, que FASOR era mais fácil para novos cirurgiões aprender do que as abordagens tradicionais para cirurgia craniana janela. Vantagens da velocidade e facilidade de utilização são susceptíveis de diferem entre cirurgiões. Preparações de crânio fina exigem tipicamente 30-45 min para "afinar" o osso com uma broca e bisturi2, enquanto a abordagem de FASOR normalmente requer menos de 10 min.
Nós achamos que em windows preparados com PHASOR nós poderia imagem transientes de cálcio nos neurônios piramidais de camada 4 no córtex motor que tinha sido transfected com vírus adeno-associado, o indicador de cálcio JRGECO1a de codificação (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). nós também achamos isso, comparado a uma janela craniana crânio fino preparada com uma broca rotativa e bisturi, a região de imagem era maior, enquanto um crânio fino preparado com uma broca rotativa e bisturi tem uma janela de imagem de 20 µm de diâmetro2 . Com FASOR, fomos capazes de diminuir rapidamente uma área de 3 a 4 mm. Isso é semelhante à janela de imagem relatada com portas4. Esta janela maior retém o benefício de imagem rápida relatado para windows crânio fino preparados com uma broca de dentista e bisturi. Além disso, a janela preparada com FASOR pode imediatamente ser fotografada, em oposição a remoção de osso tradicional windows que podem exigir a semanas para cicatrizar antes que a janela pode ser óptima imagem3.
Esta técnica pode ser aplicada para estudar alterações no fluxo sanguíneo nos vasos sob a dura-máter. Um importante estudo futuro é comparar imunorreatividade de FASOR com outros métodos de janela cranial. Isto seria importante para determinar se o FASOR produz menos inflamação em comparação com os métodos existentes. Esperamos que a técnica cirúrgica piezoelétrica documentada aqui permitirá mais laboratórios para executar windows cranianas e usar com sucesso multiphoton imagem em vivo.
Certifique-se que a peça de mão situa-se a vibrar na configuração mais baixa e que a ACSF está sendo irrigado em uma taxa constante. O frio do gelo que ACSF deve ser aplicado constantemente ou irá aquecer e danificar a dura-máter. Nós achamos que ACSF deve ser aplicado a uma taxa de pelo menos 1 mL/min. quer usar uma seringa realizada na mão, ou usar uma bomba peristáltica, ao invés da irrigação embutida na peça de mão. O sistema de irrigação na peça de mão ejeta ACSF demasiada força e produz muita turbulência, que diminuem significativamente a visibilidade.

Cirurgia craniana janela para preparar roedores multiphoton imagem latente na vivo tornou-se uma técnica importante em neurociência. A remoção ou enfraquecimento dos ossos é necessário preparar o mouse para a imagem latente ótica com um microscópio do multiphoton. Esta cirurgia é realizada removendo completamente uma área de osso para expor a dura-máter subjacente1ou diluindo-se uma região do osso sem remoção completa do dura2. A abordagem de crânio fina pode produzir menos inflamação e ativação da microglia3 mas fornece uma profundidade de imagem, um tamanho menor de janela de imagem (200 µm) e um período de tempo limitado durante o qual a janela pode ser fotografada devido à regeneração óssea2 . A adição de uma janela de vidro polido e reforçado (portas) pode aumentar o tamanho de imagem e período de imagem, mas é difícil de executar4.
Ambas as cirurgias atuais usam uma broca rotativa de alta velocidade para diluir ou remover o osso do crânio. A técnica de crânio fina também usa um bisturi após a broca para diluir ainda mais o osso2. A técnica de portas exige a etapa extra de polimento com grão4de alta velocidade. Em uma alta velocidade rotativos, uma turbina de ar alimentado ou motor elétrico faz com que a broca a girar a uma velocidade alta. Como brocas rotativas seção tanto osso e tecido mole, há um risco de danificar a dura-máter e subjacentes dos vasos sanguíneos. O sucesso da cirurgia depende da habilidade do cirurgião. Além destas janelas preparadas com métodos cirúrgicos mecânicos, um método químico de opticamente limpando o crânio com diferentes soluções tem sido desenvolvidos5,6. No entanto, desde cirurgia piezoelétrica é um método mecânico de cirurgia, nossas comparações aqui será limitadas a outros métodos mecânicos.
Piezoelétricos dispositivos cirúrgicos utilizam vibrações ultra-sônicas para quebrar osso mineralizado sem danificar tecidos moles subjacentes e assim, oferecem uma abordagem para desbastar rapidamente uma grande área de osso. Em uma peça de mão cirúrgica piezoelétrica, a turbina é substituída por uma pilha de discos de cerâmica e quando a corrente é aplicada, os discos vibram em frequências ultra-sônicas. As vibrações são transferidas através da peça de mão para diamante revestidas dicas para cortar o osso sem danificar os tecidos moles, uma vantagem sobre brocas rotativas que não discriminar entre os tipos de tecido. Cirurgia piezoeléctrica foi originalmente desenvolvida para uso em humanos por Tomaso Vercellotti e conduziu a melhorias na dental e cranio-maxilofacial cirurgia7,8,9,10,11 .
Piezoelétrica cirurgia tem sido usada para criar uma osteotomia em ratos Wistar e foi encontrada por ressonância magnética (MRI) e histologia para produzir significativamente menos dano do que um tradicional broca dental12. Os autores concluíram que cirurgia piezoeléctrica era segura para remover o osso perto de tecido cerebral macio. Ratos, no entanto, tem uma dura mais fino que é mais facilmente danificado, e esse estudo não preparou windows para a imagem latente ótica crônica. Imagem de crônica requer que os vasos sanguíneos não sejam danificados e que não formam coágulos de sangue sob a janela. Danos para a dura-máter leva a inflamação que faz com que a janela para a nuvem, e ativa a microglia e a proliferação de astrócitos reativos. Aqui, otimizamos cirurgia piezoeléctrica de ratos para criar tanto fino crânio e osso completo remoção craniana windows apropriado para a imagem latente crônica. Comparamos esta técnica cirúrgica para cirurgias cranianas janela preparado com uma broca rotativa de alta velocidade.

<table><tbody><tr><td>Piezosurgery Touch</td><td>Mectron</td><td>5120062</td><td>Piezosurgery GP model has the same settings</td></tr><tr><td>Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)</td><td>Mectron</td><td>3370019</td><td>This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.</td></tr><tr><td>Stereotax frame</td><td>Kopf</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>Mouse adaptor</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump for irrigation.</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-77120-42</td><td>Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.</td></tr><tr><td>Avitene Ultrafoam</td><td>Bard-Davol</td><td>1050020</td><td>Important to stop any minor bleeding instantly.</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B Metabond</td><td>Parkell</td><td>S380</td><td>Much stronger than regular dental acrylic.</td></tr><tr><td>Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)</td><td>Tocris</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Puralube opthalmic ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>JAX</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Prairie Ultima multiphoton microscope</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)</td><td>UPENN Vector Core</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

piezo high accuracy surgical osteal removal (phasor): a technique for improved cranial window surgery in mice

Microscopia do multiphoton foi amplamente adaptada para imagem neurônios na vivo. Imagem repetida requer a implantação de uma janela cranial ou repetidas afinamento do crânio. Cirurgia craniana janela é normalmente realizada com uma broca rotativa de alta velocidade, e muitos investigadores encontrar desafio para evitar que a broca de danificar o delicado dura-máter e os vasos sanguíneos. Prática e treinamento extensivo é necessária para remover o osso sem dano ao tecido subjacente e assim cirurgia craniana janela pode ser difícil, demorada e produzir danos nos tecidos. Cirurgia piezoeléctrica, que é amplamente utilizada para cirurgia maxilo-facial e dental, utiliza vibrações ultra-sônicas para remover o osso sem danificar os tecidos moles. Nós desenvolvemos um método de aplicação piezoelétrica cirurgia para melhorar a cirurgia craniana janela em camundongos em preparação para a imagem latente do multiphoton. Comparações dentro de nosso laboratório de acham que o método requer menos tempo de cirurgia e tem uma baixa taxa média de complicações devido a sangramento dural que a cirurgia craniana janela com uma broca rotativa.

Antes de prosseguir com a cirurgia piezoeléctrica, remova qualquer residual periósteo do crânio. Uma vez que o crânio é liso e opaco (Figura 1a), o cirurgião pode começar a cirurgia piezoeléctrica. Ao remover o osso com a ponta de piezo vibrando, é fundamental para irrigar o crânio com gelo frio ACSF. Irrigação adequada é alcançada quando a parte inferior a 1 mm da ponta é submerso em ACSF (Figura 1b). Sem irrigação adequada, o osso vai superaquecer e danificar o cérebro. Depois que o crânio diluiu-se a profundidade desejada, escolhido pelo cirurgião, pode haver algum sangramento residual de vasos sanguíneos localizados no osso. Para cessar o sangramento todos rapidamente, aplique um pedaço pequeno de 1 mm de espuma de colágeno embebida em ACSF para a área da janela. Deixe o colágeno sentar-se no crânio para aproximadamente 30 s (Figura 1C). Depois que a espuma de colágeno é removida, a janela aparecerá translúcida, permitindo a visualização clara dos vasos sanguíneos na dura-máter. A dura-máter ficará intacta sem ferimento significativo. (Figura 1D). Se a dura-máter aparece vermelho e inflamado, é provavelmente devido a vasos sanguíneos danificados de demasiada pressão aplicada à ponta durante a cirurgia. Para proteger a nova janela e prepará-lo para a imagem latente crônica, uma lamela de vidro deve ser colocada sobre a área. Uma lamela de vidro devidamente aplicada suavemente irá sentar-se no topo da janela e não causará nenhum dano para a área. A lamela de vidro deve cobrir a janela inteira. Se a lamela de vidro é corretamente aplicada no crânio, a janela permanecerá translúcida sob o vidro. Os vasos sanguíneos na dura-máter ainda será visível (Figura 1e). Dental acrílico deve ser aplicado ao redor da lamela de vidro para permanentemente aderem à superfície do crânio. As bordas da lamela de vidro também devem ser cobertas de acrílico dental (Figura 1f).
Achamos que a cirurgia piezoelétrica é tipicamente muito mais rápida do que um tradicional janela craniana, levando em torno de 10-12 min por cirurgia (Figura 2A). Também achamos que houve menos complicações devido a dura-máter hematomas e hemorragia como observado a olho nu (Figura 2B). Uma janela devidamente preparada permitirá imagens do multiphoton dos indicadores fluorescentes em neurônios corticais em vivo. Escolhemos a imagem o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a em corpos celulares dos neurônios corticais de camada 4 (Figura 3A-3B). Pudemos observar transientes de cálcio nestes corpos celulares através da janela preparado usando FASOR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig1.jpg"> Figura 1: cirurgia piezoeléctrica. (um) do crânio, depois que ele foi devidamente preparado para FASOR. Foi removido todo o tecido periosteal, deixando uma superfície lisa e limpa. (b) uma imagem representativa de FASOR em andamento. Parte inferior 1 mm de vibrar o ponta cirúrgica está submersa no gelo ACSF frio. O fluido é aplicado no crânio em uma taxa de 1 mL/min. Um leve movimento circular é aplicado para o crânio e o osso é diluído através de vibrações ultra-sônicas. (c) após diluiu-se no crânio, um pedaço circular de 1 mm de espuma de colágeno embebidas em frio que ACSF é permitido descansar na janela para parar qualquer micro sangramentos do osso. (d), A janela bem sucedida com uma dura translúcido exibe todos os vasos sanguíneos intactos. Não há nenhum dano visível ou arranhão na superfície do cérebro. (e) uma lamela de vidro é colocada sobre a janela para proteger a superfície do cérebro. (f) Dental acrílico é aplicado no crânio para corrigir permanentemente a lamela de vidro sobre a janela. Escala da barra 1 mm em todas as imagens.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig2.jpg"> Figura 2. Comparação da taxa de sucesso em treinamento para PHASOR ou dental perfurar a cirurgia. (A) tempo médio por cirurgia foi inferior para PHASOR broca dental cirurgias (p < 0.05, teste de cauda t dois) n = 30 cirurgias por grupo e a média de 10 cirurgias por cirurgião. (B), o percentual de cirurgias (definido como nenhum dano de sangramento ou visível para a dura-máter, como observado pelo olho do cirurgião através do objectivo fixado para 350 zoom X) foi superior para PHASOR broca dental cirurgias (n = 30 cirurgias para cada grupo, um teste de cauda z). Barras de erro mostram SD
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56172/56172fig3.jpg"> Figura 3. Multiphoton imagem latente na vivo através de uma janela craniana diluída com PHASOR. (A) cálcio transientes observados com o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a foram fotografadas nos neurônios piramidais murino córtex motor vivo emcamada 4. Barra de escala = 100 µm. (B) a mesma janela mas diferente região do córtex motor de camada 4. Headfixed rato com janela de 3 mm, preparado com FASOR. Barra de escala = 30 µm. Imaged com um microscópio do multiphoton, 40 X objetivo, comprimento de onda de excitação de 1040 nm.

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Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.

Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

10.6K visualizações.  Columbia University Medical Campus. Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.

Vídeo: Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

Neurociência

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of therapies to enhance fracture healing.&#160; Periosteal cells rapidly migrate to an injury to supply new chondrocytes and osteoblasts for fracture healing. Traditionally, the efficacy of a cytokine to induce cell migration has only been conducted in vitro by performing a transwell or scratch assay. With advancements in intravital microscopy using multiphoton excitation, it was recently discovered that 1) P-SSCs express the migratory gene CCR5 and 2) treatment with the CCR5 ligand known as CCL5 improves fracture healing and the migration of P-SSCs in response to CCL5. These results have been captured in real-time. Described here is a protocol to visualize P-SSC migration from the calvarial suture skeletal stem cell (SSC) niche towards an injury after treatment with CCL5. The protocol details the construction of a mouse restraint and imaging mount, surgical preparation of the mouse calvaria, induction of a calvaria defect, and acquisition of time-lapse imaging.

This protocol describes the detection of CCL5-mediated periosteal skeletal stem cell migration in real-time using live animal intravital microscopy.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

Biologia do Desenvolvimento

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal ...

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, when performing any craniotomy by hand, there is often thermal damage to brain tissue, which is inherently variable surgery-to-surgery and may be dependent on individual surgeon technique. Implementing a surgical robot can standardize surgery and lead to a decrease in thermal damage associated with surgery. In this study, three methods of robotic drilling were tested to evaluate thermal damage: horizontal, point-by-point, and pulsed point-by-point. Horizontal drilling utilizes a continuous drilling schematic, while point-by-point drills several holes encompassing the cranial window. Pulsed point-by-point adds a &#34;2 s on, 2 s off&#34; drilling scheme to allow for cooling in between drilling. Fluorescent imaging of Evans Blue (EB) dye injected intravenously measures damage to brain tissue, while a thermocouple placed under the drilling site measures thermal damage. Thermocouple results indicate a significant decrease in temperature change in the pulsed point-by-point (6.90 &#176;C &#177; 1.35 &#176;C) group compared to the horizontal (16.66 &#176;C &#177; 2.08 &#176;C) and point-by-point (18.69 &#176;C &#177; 1.75 &#176;C) groups. Similarly, the pulsed point-by-point group also showed significantly less EB presence after cranial window drilling compared to the horizontal method, indicating less damage to blood vessels in the brain. Thus, a pulsed point-by-point drilling method appears to be the optimal scheme for reducing thermal damage. A robotic drill is a useful tool to help minimize training, variability, and reduce thermal damage. With the expanding use of multiphoton imaging across research labs, it is important to improve the rigor and reproducibility of results. The methods addressed here will help inform others of how to better use these surgical robots to further advance the field.

Cranial windows have become a ubiquitously implemented surgical technique to allow for intravital imaging in transgenic mice. This protocol describes the use of a surgical robot that performs semi-automated bone drilling of cranial windows and can help reduce surgeon-to-surgeon variability and partially mitigate thermal blood-brain barrier damage.

Avaliação do Dano Térmico da Craniotomia Robotizada para Cirurgia de Janela de Crânio em Camundongos

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. Under homeostatic conditions, microglia possess a highly ramified morphology. This facilitates their monitoring of the surrounding environment through the continuous extending and retracting of their processes. During brain injury and inflammation, however, microglia become activated and undergo dramatic morphological changes, retracting their ramified processes and swelling their cell body. This facilitates activities such as migration and phagocytosis, which microglia undertake to navigate the brain environment to a less pathological state.
This close relationship between microglial morphology and changes in their activity have enabled considerable insights into various microglial functions. However, such morphological and activity changes are themselves phenomena that can result from any number of intracellular signaling pathways. Moreover, the time-lag between stimulus and response, as well as the highly compartmentalized morphology of microglia, make it difficult to isolate the causative mechanisms that underpin function. To solve this problem, we developed a genetically modified mouse line in which a highly sensitive fluorescent Ca2+-indicator protein is specifically expressed in microglia.
After describing methods for in vivo microglial Ca2+ imaging, this paper presents a structured analysis approach that classifies this Ca2+ activity to rationally defined subcellular regions, thus ensuring that the spatial and temporal dimensions of the encoded information are meaningfully extracted. We believe that this approach will provide a detailed understanding of the intracellular signaling rules that govern the diverse array of microglial activities associated with both higher brain functions and pathological conditions.

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca2+ Activity at Single-Cell Resolution

In this paper, we describe a protocol for in vivo imaging of microglial Ca2+ activity and subsequent analysis of its spatiotemporal dynamics. This method enables thorough characterization of how microglia respond to changes in the brain environment, appropriately capturing the fine spatiotemporal scales at which such events occur.

Microglia are the sole resident immune cells in the central nervous system. Their morphology is highly plastic, changing depending on their activity. ...

Protocolo integrado para FUN e fotometria de fibra em camundongos de movimento livre

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is compatible with most of the existing modalities for monitoring brain functions in vivo. Integration with brain function recording modalities not only enables us to address orders and disorders of specific brain functions with closed-loop feedback but also provides us with mechanistic insights about FUN itself. Here, we provide a modified, simple, dependable, and robust protocol for the simultaneous application of FUN and fiber photometry GCaMP6s fluorescence recording in free-moving mice. This involves the fabrication of a well-sized single transducer and its temporary placement on the mice, along with the secure fixation of a fiber optical implant to facilitate the smooth passage of the transducer. The combination of FUN and fiber photometry provides for the optical recording of neural circuitry responses upon FUN in real-time in deep brain regions. To demonstrate the efficiency of this protocol, Thy1-GCaMP6s mice were used as an example to record the neuroactivity in the anterior thalamic nucleus during FUN while the mice are freely moving. We believe that this protocol can promote the widespread use of FUN in both the neuroscience field and the biomedical ultrasound field.

Autor em destaque: Integração de fotometria de fibra e neuromodulação de ultrassom focalizado para investigar a modulação neural em camundongos que se movem livrem

The protocol includes transducer manufacturing, parameters reporting, surgical procedure, and signal recording for the entire operational workflow of concurrent focused ultrasound neuromodulation and fiber photometry recording in free-moving mice.

Neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

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Diluído crânio-técnica de janela cortical para

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

A abordagem do rato Round-janela para ototóxicos Delivery Agent: A rápida e técnica confiável para induzir a degeneração das células da cóclea

Procedimento de craniotomia para visualizar atividades neuronais no hipocampo de ratos comportadores

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

Avaliação do Dano Térmico da Craniotomia Robotizada para Cirurgia de Janela de Crânio em Camundongos

Spatiotemporal Analysis of Microglial Ca²⁺ Activity at Single-Cell Resolution

Neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre

Neuromodulação de ultrassom focalizado simultâneo e gravação de fotometria de fibra em mouse de movimento livre