Os autores gostariam de agradecer o Dr. Werner Birgit por sua ajuda com a produção deste artigo vídeo. Esta pesquisa foi financiada por uma concessão de CARREIRA NSF.

Parte 1: Preparação Experimental Procedimentos experimentais realizados em caranguejos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Universidade de Boston. Os animais são comprados dos laboratórios de Biologia Marinha (Woods Hole, MA) ou outro fornecedor e alojados em um aquário de água salgada aerada em uma sala exposta a um ciclo claro-escuro regulamentado. O esquema de iluminação é importante para entraining relógio circadiano do caranguejo e andar de bicicleta o olho diariamente entre seus estados diurnos e noturnos. Imediatamente antes de iniciar qualquer procedimento invasivo, o animal é resfriado em um balde de gelo por 10-15 minutos, até que seu movimento é lento e, em seguida, preso a uma plataforma de madeira com dois parafusos de aço inoxidável inserida no prosoma e dois na opisthosoma. A plataforma é ponderada por baixo com granito de modo a afundar na água. Após experimentos terminal o animal é sacrificado por imersão em pasta de gelo novamente e mielotomia o cérebro, que fica acima da boca, com um bisturi. Parte 2: Soluções Solução Limulus Ringer é composta de 430 mM NaCl, 9,56 mM KCl, 9,52 mM CaCl2, 9,97 mM MgCl2, 21,05 mM MgSO4, 50 ìm TES, HEPES 50 ìm e 10ml / L Pen-Strep mix (penicilina-estreptomicina, 10.000 unidades / ml) . Parte 3: Gravação Eletrorretinograma Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, vaselina, solução de Ringer, uma pipeta, um LED verde, uma câmara de gravação, parafusos de aço inoxidável, e um cotonete. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar o ERG (Figura 1A). O corpo da câmara é projetado para manter um reservatório de solução salina em contato com o olho. A tampa contém um fio de cloreto de prata para o acoplamento da solução condutora a um amplificador e um furo de pequeno porte para acomodar um LED. Um ultrabright LED com emissão de pico por volta de 520nm funciona melhor. </li><li> Para começar, a parte inferior da câmara é revestida com vaselina e garantiu sobre o olho com dois parafusos. </li><li> A câmara é então preenchido com solução salina e tampado com a tampa. </li><li> Depois de penhora câmara o caranguejo é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O cabo de LED é inserida na tampa de câmara. </li><li> A liderança do sinal é cortada ao fio, cloreto e o eletrodo referência é cortada para um dos parafusos implantados. </li><li> Ambos os terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial de alta impedância (X células 3x4, FHC Inc) para amplificação de sinal e amplificador de o filtro está definido para passar freqüências abaixo de 10Hz. </li><li> A saída do amplificador é alimentado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Após a instalação a porta da gaiola está fechada para bloquear a luz da sala de atingir o animal. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa pisca o LED, registra o evocado ERG sinal, e mede a amplitude da resposta pico a pico. A escolha do paradigma de flash depende do objetivo experimental. Por exemplo, uma breve (100ms) pulso de 5V aplicada a cada 10 minutos para o LED evita efeitos de adaptação luz quando o monitoramento de mudanças circadiano na sensibilidade dos olhos. </li></ol> Parte 4: gravação do nervo óptico Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, fio, um trépano, solução de Ringer, fórceps, tesouras Vannas, uma câmara de gravação, uma pinça curva, sondas agulha fina, um maçante bisturi, tesouras cirúrgicas, e um eletrodo de sucção. <ol><li> Uma câmara à mão é usado para gravar as respostas do nervo óptico (Figura 1B). O interior da câmara é dois centímetros de diâmetro, bem aberto que tem uma abertura semicircular fina fenda na parede inferior para acomodar o nervo e isolá-lo do tecido circundante. </li><li> Antes de penhora câmara de uma agulha de calibre 16 é inserido entre os músculos da dobradiça para o coração e ~ 20cc de sangue é drenado do animal. Exsanguination não é necessária, mas torna a dissecção do nervo óptico mais fácil. </li><li> A localização do nervo óptico é estimado pelo desenho na carapaça de uma linha ligeiramente curva entre os olhos laterais e mediana. </li><li> Um buraco circular é então cortada na carapaça com uma trefina. O buraco é o mesmo diâmetro que a câmara também. O centro do buraco está localizado 2-3 cm anterior ao olho lateral e ligeiramente dorsal à linha para que o nervo percorre a porção ventral do poço. </li><li> Tecido conjuntivo é liberado até que o nervo é totalmente visível e livre de torno e subjacentes do tecido. </li><li> Um fio de linha é enrolada ao redor do nervo e puxou para dentro da câmara através da ranhura na parte inferior. Através desta mesma abertura do nervo é suavemente guiado para a câmara, puxando a corda. Ao mesmo tempo, a câmara também é inserido no furo. A câmara é então aposta a carapaçacom parafusos eo poço é preenchido com solução de Ringer. </li><li> Depois de penhora câmara o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O bem é visualizado sob um estereoscópio (SMZ-168, Jed Pella Inc) e algodão é preenchido em torno da abertura no fundo para evitar fugas de sangue e soro fisiológico para fora da câmara. </li><li> Tecido conjuntivo residual ao redor do nervo é removida com tesoura fina e pinça, ea câmara é abastecido com solução de Ringer fresco é. </li><li> Um nick é feita no vaso sanguíneo que encapsula o nervo e, através desta abertura que o nervo é cuidadosamente desheathed longo de seu comprimento com uma tesoura fina, pinças, sondas e agulhas. </li><li> Um feixe de fibras minúsculas é separado do nervo utilizando a sonda e corte no final mais afastada do olho para a gravação de fibras aferentes e no final mais próximo ao olho para a gravação de fibras eferentes. No vídeo o fim das gravações de fibra aferente é cortado. </li><li> Um eletrodo microsuction (AM Systems Inc) preenchidas com solução de Ringer é usado para a gravação do nervo óptico. A ponta do eletrodo é montado no feixe de nervos pelo fogo polimento final de um vidro de borosilicato 1 milímetro de diâmetro capilar. </li><li> A ponta do eletrodo é rebaixada para a câmara de bem com um manipulador manual (WPI Inc), eo feixe de fibras cortadas é sugado para a ponta. Sucção é fornecido por uma seringa Gilmont conectados ao eletrodo por meio de tubulação. </li><li> Uma conexão BNC fornece a liderança de sinal e um fio de cloreto de prata enrolada em torno do eletrodo para reduzir o ruído fornece a liderança de referência. Os dois terminais estão conectados ao palco cabeça de um amplificador diferencial para a amplificação do sinal e filtragem de ruído (X células 3x4, FHC Inc). A saída do amplificador é enviado a um osciloscópio para visualização e uma placa de aquisição de dados para análise e armazenamento de computador. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em LabView. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Cambridge Research Systems Inc) e interfaces digitais com um pico discriminador (APM, FHC Inc) que os registros de trens de pico. A luz pode ser entregue a uma única célula no olho através de um tubo de luz de fibra óptica ou para todo o olho através de um display de vídeo controlado por computador. </li></ol> Parte 5: gravação intra Ferramentas necessárias para este procedimento incluem uma chave de fenda, uma em forma de L plataforma de acrílico com furos roscados, um suporte de microeletrodos com uma pipeta de vidro, parafusos de aço inoxidável, pinças e um bisturi fino. <ol><li> Uma placa de acrílico artesanais com furos pré-é usado para gravar as respostas intracelulares. Os furos são espaçados para a montagem de um micromanipulador motorizado (PPM5000, WPI Inc). A placa é anexado ao animal com dois parafusos na lateral e um na parte superior. </li><li> Após fixação da placa o animal é colocado em uma gaiola à prova de luz em um tanque cheio de água do mar sobre as brânquias. </li><li> O microposicionador é parafusada na placa, com o seu braço móvel alinhado sobre o olho. </li><li> Um lote de micropipetas de vidro são puxados a partir de 1 mm OD vidro borossilicato e as pontas são backfilled via ação capilar, colocando o micropipetas em um pequeno frasco de solução de KCl 3M. </li><li> O resto das pipetas são preenchidos manualmente com a solução de sal e inserido em um suporte do eletrodo. </li><li> O suporte do eletrodo é conectado ao palco a cabeça de um amplificador intracelular (IR-283, Cygnus Technology Inc) aposta no braço microposicionador. </li><li> Uma seção pequena da retina (~ 1mm2) é exposto pelo corte de distância da interface córnea com uma lâmina de barbear. </li><li> Uma gota de solução de Ringer é colocado na retina exposta para evitar a secagem ea ponta micropipeta é avançada através da abertura no tecido da retina. </li><li> Quando a ponta entra na solução, o modo de injeção de corrente do amplificador intracelular está envolvido e impedância de eletrodo é medido. Micropipetas com impedância fora do intervalo de 20-70 MW são descartados. Aqueles nesta faixa são avançados em passos micron e empalado em células vibrando a ponta da pipeta eletronicamente ou mecanicamente. </li><li> Três tipos de células podem ser encontradas no olho. Retinular células apresentam apenas uma resposta despolarizante à luz, as células excêntrico mostram um trem de potenciais de ação montado em uma resposta despolarizante, e as células de pigmento não mostram nenhuma resposta clara a todos. </li><li> Os dados são coletados com um programa personalizado escrito em Labview. O programa controla os estímulos de luz através de um processador de vídeo digital (Bits + +, Sistemas de Cambridge Research). Os estímulos são entregues às células empalado com um tubo de fibra óptica ou exibição de vídeo. Respostas de tensão são observados no osciloscópio e digitalizados pelo programa para computador. </li></ol> Parte 6: Resultados Representante A ERG representativa é mostrado na Figura 2A. A forma de onda representa a elétrica resumiuresposta à luz dos principalmente a células fotorreceptoras retinular, uma vez que em muito ultrapassam as células excêntrico e são eletricamente acoplados a eles. Não há forma de onda componentes múltiplos de diferentes tipos de células da retina como com o ERG de mamíferos. Retorno de um relógio circadiano no cérebro Limulus modula as propriedades fisiológicas das células da retina em uma base diária, fazendo com que o curso amplitude e tempo do ERG para variar ao longo do tempo (1). Conforme mostrado na Figura 2B, ERG amplitude é maior durante a noite subjetiva do animal menor e durante o dia subjetiva. Um traço de representante de uma resposta de fibra do nervo óptico único para a luz é mostrado na Figura 3. Células excêntricas todos se comportam da mesma ordem, mostrando um aumento transitório na taxa de descarga pico seguido de uma decadência a um nível sustentado. A decadência taxa reflete a ação combinada de adaptação luz e aumento dependente da auto-inibição em células excêntricas (2). Outros padrões espiga, como a luz-dependente diminui na taxa, são vistos no cérebro Limulus, mas não o olho (3). Traços representativos da resposta de tensão de uma célula de células de pigmento, células retinular, e excêntrico à luz são mostrados na Figura 4. Apenas os dois últimos tipos de células da retina são visuais. O curso de amplitude e tempo de sua resposta depende da qualidade da gravação e da localização do eletrodo no interior da célula. Geralmente, o eletrodo penetra nas células de pigmento ou células retinular por causa de seu grande tamanho e número. Neste último caso, uma despolarização transitória que decai a um nível sustentado é gravado. A decadência é devido à adaptação de luz por células retinular (2). Se o eletrodo entra em uma célula excêntrico, grandes potenciais de ação são registrados no axônio (40-70mV) e potenciais de ação pequeno montado em uma forma de onda despolarizante (&lt;25mV) perto da soma. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig1.jpg" alt="figura 1" /> Figura 1. Diagramas esquemático das câmaras utilizadas para a gravação eletrorretinograma (A) e gravação de nervo óptico (B). Bar é igual a 7mm de A e 5mm de B. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Traço Exemplo de um ERG Limulus evocado por um pulso de 100ms LED 5V no escuro (A) ea flutuação pico-a-pico em ERG amplitude ao longo do tempo na escuridão constante (B). Escuridão foi iniciado no momento indicado pelo triângulo branco. O crescimento da amplitude do ERG durante o tempo indicado pelo triângulo preto é devido à adaptação de luz, que aumenta a sensibilidade do olho no escuro. A variação cíclica na amplitude do ERG depois disso é devido ao relógio interno do animal circadiano. Pontos no tempo B são cada 5min. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig3.jpg" alt="figura 3" /> Figura 3. Traço Exemplo de uma resposta do nervo óptico de fibra à luz brilhou em um único receptor ommatidial. Forma de onda acima do rastreamento mostra momento estímulo. Células excêntricas, cujos axônios dão origem a fibras nervosas, todas apresentam um padrão semelhante de disparar como este nas condições de iluminação do experimento (5 segundos o flash no escuro total). Codificação da retina com picos é um Limulus propriedade tem em comum com mamíferos, ao contrário de outros invertebrados. <img src="/files/ftp_upload/1384/1384fig4.jpg" alt="figura 4" /> Figura 4 traços Exemplo da resposta de tensão à luz dos três tipos de células presentes no olho Limulus lateral:. Células de pigmento (A), célula retinular (B), e célula excêntrico (C). A primeira célula é não-visual. Os dois últimos despolarizar em cima de um flash de luz. A despolarização é maior para as células retinular porque transdução da luz e enviar o sinal através de junções para a célula excêntrico, com alguma perda ao longo do caminho. Na célula excêntrico, potenciais de ação disparados pelo axônio são vistos andando sobre a despolarização devido à backpropagation pico na soma. A amplitude dos potenciais de ação tem sido atenuada na figura para melhor visualização do potencial despolarizante. O potencial de repouso das células é-50mV.

<ol>
	<li>Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+in+the+Limulus+visual+system.">Circadian rhythms in the Limulus visual system.</a> J. Neurosci. 3, 856-870 (1983).</li><li>Passaglia, C. L., Dodge, F. A., Barlow, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+based+model+of+the+Limulus+lateral+eye.">Cell based model of the Limulus lateral eye.</a> J. Neurophysiol. 80, 1800-1815 (1998).</li><li>Snodderly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+visual+inputs+by+the+brain+of+Limulus.">Processing of visual inputs by the brain of Limulus.</a> J. Neurophysiol. 34, 588-611 (1971).</li><li>Passaglia, C., Dodge, F., Herzog, E., Jackson, S., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+a+neural+code+for+vision.">Deciphering a neural code for vision.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 12649-12654 (1997).</li><li>Barlow, R. B., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limulus+lateral+eye:+properties+of+receptor+units+in+the+unexcised+eye.">Limulus lateral eye: properties of receptor units in the unexcised eye.</a> Science. 174, 1027-1029 (1971).</li><li>Bolbecker, A. R., Lewis, A. R., Swan, A. A., Carlson, K., Fleet, J. R., Beck, K. E., Wasserman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+Bellows+Cup+Electrode+Demonstrates+Low-frequency+Properties+of+Long-term+Electroretinographic+Recordings+in+the+Limulus+Lateral+Eye.">Stable Bellows Cup Electrode Demonstrates Low-frequency Properties of Long-term Electroretinographic Recordings in the Limulus Lateral Eye.</a> J. Neurosci. Meth. 159, 252-260 (2007).</li></ol>

Nós ilustramos como realizar gravações ERG, gravações nervo óptico, e gravações de caranguejos-ferradura intra-in vivo. As técnicas de gravação cada fornecer informações diferentes sobre a base neural da visão, e todos eles podem ser usados ​​para estudar a função da retina em animais vivos graças aos olhos grandes do caranguejo e da carapaça dura. Atividade do nervo óptico pode até mesmo ser gravado a partir de animais se comportando livremente no oceano com a construção adequada de eletrodos ...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>LED</td>
<td>Light source</td>
<td>Newark Inc</td>
<td>33C1292</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Suction electrode</td>
<td>Electrode</td>
<td>A-M Systems, Inc</td>
<td>573000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>XCell 3*4-Channel Extracellular Amplifier</td>
<td>Amplifier</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>40-40-8B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Intracellular Recording</td>
<td>Amplifier</td>
<td>Cygnus</td>
<td>IR-283A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>APM</td>
<td>Neural Spike Discriminator</td>
<td>FHC Inc.</td>
<td>APM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bits++</td>
<td>Video Board</td>
<td>Cambridge Research Systems Inc</td>
<td>Bits++</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Piezopatch Manipulator</td>
<td>Micropositioner</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>PPM5000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Square Pulse Stimulator</td>
<td>Nerve Stimulator</td>
<td>Grass Instrument Division, Astro-Med, Inc.</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate Glass Capillary</td>
<td>Electrode glass</td>
<td>WPI Inc</td>
<td>1B150-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Horseshoe crab (Limulus polyphemus)</td>
<td>Animal</td>
<td>Marine Biological Laboratories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette Puller</td>
<td>Glass Puller</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>P-97</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zoom Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Jed Pella Inc.</td>
<td>SMZ-168</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

using the horseshoe crab, limulus polyphemus, in vision research

O caranguejo-ferradura americano, Limulus Polifemo é uma das mais antigas criaturas na terra, eo animal continua a desempenhar um papel indispensável na pesquisa biomédica. Não só o seu sangue contém células especiais que os cientistas usam para detectar bacteriotoxins em nossos medicamentos, mas seus olhos também contêm uma rede neural que tem proporcionado uma visão muito sobre os processos fisiológicos que operam em nosso sistema visual, como a adaptação de luz e inibição lateral. O caranguejo-ferradura continua a ser um modelo atraente para a investigação da visão porque o animal é grande e resistente para um invertebrado, seus neurônios da retina são grandes e de fácil acesso, seu sistema visual é compacto e extensivamente estudado, e seu comportamento visual é bem definida. Além disso, a estrutura eo funcionamento dos olhos são modulados em uma base diária por um relógio circadiano no cérebro do animal s. Em suma, o sistema visual de caranguejos-ferradura é bastante simples de ser entendido ainda complexo o suficiente para ser interessante. Neste vídeo apresentamos três paradigmas eletrofisiológicos para investigar as bases neurais da visão que podem ser realizados in vivo com Limulus. Eles estão gravando eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra. Eletrorretinograma (ERG) gravações medida com uma superfície do eletrodo a resposta resumiu elétrica de todas as células do olho para um flash de luz. Eles podem ser usados ​​para monitorar a sensibilidade global do olho para prolongar os períodos de tempo. Gravações nervo óptico medir a atividade spiking de fibras nervosas individuais com um eletrodo microsuction extracelular. Elas podem ser usadas para estudar as mensagens visuais transmitidas do olho para o cérebro, bem como relógio circadiano-alimentado de volta mensagens do cérebro para os olhos. Medida intra gravações com um microeletrodo intracelular as flutuações de tensão induzida pela luz em células individuais do olho. Elas podem ser usadas para elucidar os mecanismos celulares de processamento da retina.

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Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura,<em&gt; Limulus Polyphemus</em&gt;. Esses paradigmas eletrofisiológicos pode ser usado para investigar as bases neurais da visão em um laboratório de pesquisa ou ensino.

Usando o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus, Em Vision Research

The American horseshoe crab, Limulus Polyphemus is one of the oldest creatures on earth, and the animal continues to play an indispensable role in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

14.2K visualizações.  Boston University. Neste vídeo podemos executar a gravação eletrorretinograma, a gravação do nervo óptico e gravação intra-americano com o caranguejo-ferradura, Limulus Polyphemus. Esses paradigmas eletrofisiológicos pode ser usado para investigar as bases neurais da visão em um laboratório de pesquisa ou ensino.

Vídeo: Using the Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus, in Vision Research

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Biologia

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogênese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) human corneal epithelial cell cultures. Cells were exposed to UV radiation and toxic doses of benzalkonium chloride (BAK), hydrogen peroxide (H2O2), and sodium dodecyl sulfate (SDS). Metabolic activity was measured using a metabolic assay. The release of inflammatory cytokines was measured using a multi-plex interleukin (IL)-1&#946;, IL-6, IL-8, and tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) assay, and cells were evaluated for viability using fluorescent dyes. 
The damaging effects of UV on cell metabolic activity and cytokine release occurred at 5 min of UV exposure for iHCEC and 20 min for pHCEC. Similar percent drops in metabolic activity of the iHCEC and pHCEC occurred after exposure to BAK, H2O2, or SDS, and the most significant changes in cytokine release occurred for IL-6 and IL-8. Microscopy of fluorescently stained iHCEC and pHCEC BAK-exposed cells showed cell death at 0.005% BAK exposure, although the degree of ethidium staining was greater in the iHCECs than pHCECs. Utilizing multiple methods of assessing toxic effects using microscopy, assessments of metabolic activity, and cytokine production, the toxicity of UV radiation and chemical toxins could be determined for both primary and immortalized cell lines.

This article describes the procedures used to evaluate the toxicity of UV radiation and chemical toxins on a primary and immortalized cell line.

Determinação da Toxicidade da Radiação UV e Produtos Químicos em Células Epiteliais Primárias e Imortalizadas da Córnea Humana

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Fluxos de trabalho GDT, análise de resultados e gerenciamento de dados usando uma abordagem de visão de máquina

A Machine-Vision Approach to Transmission Electron Microscopy Workflows, Results Analysis and Data Management

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate thousands of images with numerous parameters that require time-consuming and complicated analysis. AXON synchronicity is a machine-vision synchronization (MVS) software solution designed to address the pain points inherent to TEM studies. Once installed on the microscope, it enables the continuous synchronization of images and metadata generated by the microscope, detector, and in situ systems during an experiment. This connectivity enables the application of machine-vision algorithms that apply a combination of spatial, beam, and digital corrections to center and track a region of interest within the field of view and provide immediate image stabilization. In addition to the substantial improvement in resolution afforded by such stabilization, metadata synchronization enables the application of computational and image analysis algorithms that calculate&#8239;variables between images. This calculated metadata can be used to analyze trends or identify key areas of interest within a dataset, leading to new insights and the development of more sophisticated machine-vision capabilities in the future. One such module that builds on this calculated metadata is dose calibration and management. The dose module provides state-of-the-art calibration, tracking, and management of both the electron fluence (e-/&#197;2&#183;s-1) and cumulative dose (e-/&#197;2) that is delivered to specific areas of the sample on a pixel-by-pixel basis. This enables a comprehensive overview of the interaction between the electron beam and the sample. Experiment analysis is streamlined through a dedicated analysis software in which datasets consisting of images and corresponding metadata are easily visualized, sorted, filtered, and exported. Combined, these tools facilitate efficient collaborations and experimental analysis, encourage data mining and enhance the microscopy experience.

Autor em destaque: Uma abordagem de visão de máquina para fluxos de trabalho de microscopia eletrônica de transmissão, análise de resultados e gerenciamento de dados  

Here, we present a protocol to utilize machine-vision software to stabilize dynamic processes during TEM imaging, while concurrently indexing multiple streams of metadata to each image into a navigable timeline. We demonstrate how this platform enables automated calibration and mapping of the electron dose over the course of an experiment.

Uma abordagem de visão mecânica para fluxos de trabalho de microscopia eletrônica de transmissão, análise de resultados e gerenciamento de dados

Transmission electron microscopy (TEM) enables users to study materials at their fundamental, atomic scale. Complex experiments routinely generate ...

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the protocol is to emphasize the correct techniques used in a research laboratory to prevent contamination from fungi and bacteria. Special emphasis is placed on avoiding mycoplasma contamination, a major concern in the cell culture room due to its small size and resistance to most antibiotics used for cell culture. These same techniques ensure continuous growth and maintain healthy cells. For new and experienced cell culture users alike, it&#8217;s important to consistently adhere to these best practices to mitigate the risk of contamination. Once a year, laboratories should review cell culture best practices and follow-up with a discussion or additional training if needed. Taking early action to prevent contamination in the first place will save time and money, as compared to cleaning up after contamination occurs. Universal best practices keep cell cultures healthy, thereby reducing the need to constantly thaw new cells, purchase expensive cell culture media, and reducing the amount of incubator decontamination and downtime.&#160;

This protocol presents essential cell culture techniques and practices to be used in the research cell culture laboratory to avoid contamination by fungi and bacteria. Within the category of bacteria, special emphasis will be placed on preventing mycoplasma contamination.&#160;&#160;

Técnicas e práticas de cultura celular para evitar a contaminação por fungos e bactérias no laboratório de cultura de células de pesquisa

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...