Nosso protocolo facilita a preparação de camundongos geneticamente modificados de forma fácil, eficiente e rápida a partir de embriões de camundongos de célula única. Nosso protocolo combina o uso de embriões de estágio de uma célula congelante e eletroporação permitindo a rápida geração de camundongos geneticamente modificados, incluindo os camundongos mutantes em alta eficiência e baixas taxas de mosaico. Para fertilização in vitro, comece por camundongos C57BL/6J fêmeas super ovulando de quatro ou oito semanas de idade através de injeção intraperitoneal de 7,5 unidades internacionais de gonadotropina égua grávida seguida de injeção intraperitoneal de 7,5 unidades internacionais de gonadotropina coriônica humana 48 horas depois.
Em seguida, remova a cauda epidídmis de camundongos C57BL/6J machos sexualmente maduros de três a cinco meses de idade e use uma agulha dissecando para extrair coágulos de espermatozoides. Em seguida, incubar os coágulos em uma queda de 200 microliter de HTF a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 1,5 horas para capacitação. 16 a 18 horas após a injeção de gonadotropina coriônica humana, coletar complexos de oócito cumulus dos ovidutos e incubar os complexos com 200 microliters de HTF cobertos com parafina líquida para uma incubação de no máximo duas horas na incubadora de cultura celular.
Ao final da incubação, adicione um a cinco microlitadores de suspensão de esperma do limite do meio de incubação à queda de 200 microliteres de complexos de oócito cumulus e coloque a co-cultura na incubadora de cultura celular por três horas. No final da incubação, lave os oócitos com micro-otimização de potássio suplementados três vezes para remover qualquer esperma restante e células cumulus e use um microscópio invertido para verificar a formação pronuclear e o grau dos embriões de uma célula. Para uma criopreservação de embriões celulares, transfira os embriões para uma nova gota de 200 microliteres de HTF suplementada com soro bovino fetal de 20% para uma incubação de 10 minutos na incubadora de cultura celular.
Ao final da incubação, transfira de 20 a 100 embriões para 50 microlitres de uma solução de sulfóxido de dimetil molar e transfira até 100 embriões em cinco microlitrais de solução para o fundo de um crioboto. Esfrie os embriões por cinco minutos a zero graus Celsius antes de adicionar 45 microliters de solução DAP213 na lateral do tubo. Após o capping, mantenha as células por mais cinco minutos a zero graus Celsius antes de armazenar rapidamente o tubo em nitrogênio líquido.
Prepare um micrograma por microfeitor de RNA CRISPR e um micrograma por microfeitir de tracrRNA em meio essencial mínimo de soro reduzido. Adicione seis microliters de cada solução de RNA a 42 microliters de tampão sem nuclease e coloque a mistura em um aquecedor seco por três minutos a 95 graus Celsius. No final da incubação, esfrie a mistura à temperatura ambiente por cinco minutos e prepare um micrograma por microfeito de proteína HiFi Cas9 com meio essencial mínimo de soro reduzido.
Adicione seis microliters da solução HiFi Cas9 diluída à solução RNA e transfira até 100 embriões descongelados em 25 microlitrais da solução complexa de ribonucleoproteína resultante em um slide de vidro inteiro. Em seguida, incubar embriões por 10 minutos a 37 graus Celsius. Para eletroporação de embriões, no final da incubação, defina os parâmetros do eletroporador e carregue o slide no eletroporador.
A eletroporação deve ser realizada dentro de uma hora após o descongelamento do embrião para garantir que a edição do genoma ocorra antes da primeira replicação do DNA e para prevenir o mosaico. Após a eletroporação, lave os embriões três vezes com tampão bicarbonato Krebs-Ringer modificado dois meios em duas lavagens com uma gota de maciá-lo complementado meio de otimização simples coberto com parafina líquida. Em seguida, incubar os embriões em potássio fresco complementado meio de otimização simplex na incubadora de cultura celular durante a noite.
O uso deste método de criopreservação modificado para embriões unicelulares melhora a taxa de desenvolvimento dos embriões congelados para o estágio de duas células. Usando este método, todos os ratos gerados neste experimento representativo eram albinos com apenas um rato de mosaico carregando um casaco com manchas brancas e pretas. Aqui pode ser observada uma seção representativa de um cromatograma de um rato albino contendo o alelo M1.
Como ilustrado, o protocolo pode gerar ratos nocaute e knock-in com alta eficiência e baixas taxas de mosaico. De fato, os descendentes de F1 de descendentes homozigos F0 são heterozigos contendo um macaco mutante e um alelo tipo selvagem sem mutações diferentes. Lembre-se que o óvulo fertilizado é frágil em um estágio de uma célula.
A adição de soro bovino fetal reforça o embrião. No entanto, deve ser tratado cuidadosamente a cada passo. Este método pode contribuir para a análise da função genética e da pesquisa em doenças humanas, facilitando uma produção mais rápida e eficiente de camundongos geneticamente modificados.
