Os autores são gratos a Joachim Theussl (centro de pesquisa médica, universidade médica de Graz) para a excelente assistência técnica na produção da vídeo e a Monica Farrell (gestão de pesquisa, universidade médica de Graz) como talento de voz.

Protocolo e tiro vídeo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da universidade médica de Graz (Votum 27-126ex14/15). Consentimento por escrito para a publicação deste vídeo foi obtido por seu pai e o filho.
1. os instrumentos e materiais
<ol>
	<li>Corte calibrado (ISO 015/02) e pontos de papel estéril, geralmente utilizados na terapia endodôntica, na primeira marca de anel a fim de padronizar o seu comprimento (Figura 1).</li>
	<li>Aplicar a irradiação de luz UV a 260 nm por 30 min para evitar a contaminação de DNA e RNA dos pontos de papel (Figura 2).</li>
	<li>Autoclave os tubos para o armazenamento a 120 ° C e 1,2 bar por 20 min e UV-irradiar-lhes também ou empregar ready-to-use gama irradiados tubos.</li>
</ol>
2. preparação dos temas
Nota: Escrito consentimento informado foi obtido o filho e seu pai antes da inscrição.
<ol>
	<li>Aplique manteiga de cacau para os lábios.</li>
	<li>Montar a bochecha e língua afastador para completo de ambos os arcos dentários.</li>
	<li>Mancha a placa dentária com divulgação de placa.</li>
	<li>Retire o aparelho do campo seco.</li>
	<li>Enxague a boca com água até que a água é incolor.</li>
	<li>Escove bem os dentes com uma escova de dente elétrica na angulação de 45 °. Aplica água só, mas sem pasta de dente, como isto alteraria o biofilme oral.</li>
	<li>Monte o aparelho de campo seco novamente, incluindo a guarda de língua para manter a boca aberta e seca.</li>
	<li>Limpos e secos os dentes do índice cotonetes estéreis para evitar a absorção de fluido supragengival durante papel ponto de amostragem.</li>
</ol>
3. biofilme amostragem
<ol>
	<li>Ponto de amostragem do sulco subgengival de papel
	<ol>
		<li>Compreender os pontos de papel com uma pinça estéril de dental.</li>
		<li>Inserir pontos de papel tangencialmente até para um comprimento definido de 4 mm. Tome especial cuidado para não traumatizar o epitélio juncional (Figura 3).</li>
		<li>Remover pontos de papel após 20 s.</li>
		<li>Acumule pontos de papel diretamente nos tubos preparados: Coloque a ponta de papel ponto diretamente em um frasco estéril e livre de DNA e cortá-lo na terceira marca a um comprimento padronizado de 4 mm (Figura 4).</li>
		<li>Se indicado pelos protocolos de estudo, inseri dois pontos de papel paralelos e simultaneamente no mesmo local (Figura 5A).</li>
		<li>Alternativamente, recolher pontos de papel de vários sites, se o protocolo de estudo requer "amostras em pool" (Figura 5B).</li>
		<li>Retirar o aparelho do campo seco para mucosas e recolha de amostras de saliva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Papel da mucosa ponto de amostragem
	<ol>
		<li>Aplicam-se pontos de papel para a prega vestibular da face superior (Figura 6).</li>
		<li>Feche a bochecha e massageá-lo brevemente.</li>
		<li>Abra a face e remover os pontos de papel após 20 s.</li>
		<li>Cortar os pontos do papel na terceira marca e colocá-los em um tubo estéril como indicado para amostragem subgengival.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Recolha de amostras de saliva
	<ol>
		<li>Deixe a criança cuspir saliva unstimulated dentro de um vaso coleção esterilizado (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. transferência e armazenamento
<ol>
	<li>Acumule pontos de papel como amostras simples, em pool ou paralelas, dependendo do projeto de estudo (Figura 8).</li>
	<li>Aplica um sistema de armazenamento codificados por cores para facilitar ainda mais a gestão de amostra (Figura 9).</li>
	<li>Finalmente, armazene as amostras em −80 ° C pendente microbiome análise.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque.">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li><li>Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Normal+Bacterial+Flora+of+the+Oral+Cavity.">Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).</li><li>Ledder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Analysis+of+the+Subgingival+Microbiota+in+Health+and+Disease.">Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease.</a> Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).</li><li>Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+healthy+'core+microbiome'+of+oral+microbial+communities.">Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities.</a> BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).</li><li>Alcaraz, L. 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Os autores relatam que não há conflitos de interesse relacionados com esta produção científica de vídeo.

As bactérias são encontradas em todos os locais dentro da cavidade oral24,25,26. Muitos estudos têm-se centrado sobre o uso de saliva como um meio de amostragem para mapear a colonização oral como isso facilmente pode ser saboreado através de cuspindo27,28,29,30,31, 32. No entanto, biofilme salivar não reflete composição do biofilme subgengival. Assim, o uso de outros métodos de amostragem é crucial para a criação de toda a imagem e evocará novas discussões na pesquisa odontológica. Vários artigos de comparam o uso de Curetas e pontos de papel para amostragem subgengival de indivíduos doentes remover8,33,34. Ainda nenhum grupo de pesquisa é conhecido por centraram-se sobre a aplicação de dispositivos de amostragem padronizada para diferentes faixas etárias, especialmente para crianças,19.
Neste vídeo, é apresentada o biofilme oral amostragem de três habitats orais em crianças saudáveis.
Modificações e solução de problemas:
O objetivo do manuscrito enfoca o protocolo clínico para recolha de amostras de biofilme subgengival de crianças saudáveis. O método de escolha refere-se ao som sulci subgengival onde o espaço limitado torna especialmente desafiador de amostragem. Neste vídeo, o método foi aplicado a dentição permanente precoce. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura e para crianças e/ou adultos. Nosso método de amostragem permite modificações como única ou em pool de amostras. Este último pode tornar-se um fator crucial para análises moleculares devido à pequena quantidade de DNA colecionável do sulco subgengival saudável. A escolha dos dentes índice pode ser modificada sob demanda; em particular, outro dente pode ser incluídos na amostra como uma alternativa quando o epitélio é traumatizado e sangrando, tornando o ponto de papel inutilizável. Amostragem paralela usando dois pontos de papel simultaneamente em um local processa amostra repetições em uma única etapa, além de encurtar o tempo de cadeira para crianças.
Com pequenas modificações podem ser degustadas doentes periodontais. Aqui pontos papel precisará ser inserido em todo o comprimento do bolso, que pode atingir até 10 mm. O comprimento e conus dos pontos de papel, bem como a profundidade de inserção devem ser adaptados ao habitat intra-oral de interesse, mas sempre deve ser padronizado pelo material e dimensões. Podem também ser recolhidas amostras de mucosa usando pontos de papel. Protocolos idênticos permitem comparações de diferentes habitats orais e vários materiais dentários. Preparação do paciente e armazenamento da amostra podem ser realizadas conforme descrito neste vídeo. Para pesquisa de metatranscriptome, RNA pode ser saboreado com o mesmo método. Assim, após a amostragem, os pontos de papel devem ser inseridos diretamente na solução de estabilização de RNA.
Limitações da técnica:
Independentemente de modificações, o método de amostragem clínicos que descrevemos é limitado ao som sulco subgengival. Outros locais de amostragem, quanto remover doentes bolsos de exemplo, não eram parte do nosso projeto de estudo. Como amostragem de toda a profundidade de tais bolsas é necessário, pontos de papel podem não ser grandes o suficiente para coletar amostras suficientemente. Se o objetivo experimental é comparar os dados amostrados de som sulci subgengival e bolsos remover doentes, é importante estar ciente de viés inerente associado com métodos de amostragem clínicos diferentes. Portanto, não é aconselhável comparar esses dados.
Uma limitação do método aqui apresentado é amostragem sem o uso subsequente de propidium monoazídico. Adicionar este agente diretamente após a amostragem permite a análise específica de apenas as células vivas no biofilme analisados. O método de amostragem descrito aqui reflete o número de células vivas e mortas. Para a pesquisa da periodontite severa, pontos de papel provavelmente precisará ser substituído por curetas, como formação de biofilme em bolsos é forte. Ponto de papel amostragem pode não refletir a todo o espectro microbiano nestes casos, como a sua superfície pode ser saturado muito rapidamente.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
O manuscrito proposto é o primeiro de seu tipo para padronizar subgengival amostragem no sulco saudável com pontos de papel. Outros relatórios referiram-se ao uso de curetas metal35,36 ou papel pontos 37,38,39, mas não descrever os processos que ocorrem antes da amostragem, tais como o controle de placa bacteriana, limpeza do dente, dente isolamento e secagem, bem como os processos que resultam de especificações inadequadas nas linhas de técnica e tempo de amostragem.
Em dois artigos anteriores, mostramos que o uso de pontos de papel é um método reprodutível para recolha de amostras de biofilme subgengival em crianças22,40. Devido ao seu design, curetas são demasiado grandes para o sulco raso com espaço limitado e muito afiada para o epitélio juncional concurso. É crucial acessar o sulco subgengival sem traumatizar o epitélio. Desta forma, evita-se preconceito decorrentes da hemorragia. Assim, o uso dos pontos de papel fino e macio é preferencial para esta área. Pontos de papel são funcionais para monitorar as alterações na composição do biofilme durante o tratamento ortodôntico21,41. Eles são magros e flexível o suficiente para caber entre os elementos dos aparelhos ortodônticos fixos. Esta é uma grande vantagem para outros métodos de amostragem como curetas. Atraumatic amostragem é simplificada e amostragem de pequenas quantidades de DNA é possível.
Aplicações futuras:
Neste vídeo demonstramos o método na dentição permanente, precoce e não-doentes. Também pode ser aplicado à dentição mista ou madura. Com algumas adaptações é possível remover doentes sites como dentes ou implantes e outros nichos devido a materiais dentários da amostra, seguindo o mesmo protocolo. Pesquisa de cárie pode beneficiar deste protocolo padronizado, em particulares estudos sobre cárie de raiz. A palestra mais importante de nossa vídeo de amostragem é a padronização dos protocolos para tornar os dados comparáveis, não importa o que e como as amostras são medidas.Futuras demonstrações de vídeo poderiam melhorar o campo de colheita de amostras clínicas em geral.
Biofilme oral obtido como mostrado no vídeo é usado em clínicas e para investigações científicas. Esta abordagem na vivo representa uma boa adição a em vitro técnicas moleculares como a hibridação do in situ de fluorescência e microscopia15de exploração do laser confocal. NGS métodos, como mostrado aqui, o pyrosequencing aplicada para o biofilme coletado, permitem a análise da microbiota completa. Calcular a abundância relativa de certas espécies bacterianas pode ser usado para tratamentos de suporte ou para comparar diferentes pacientes ou tratamentos diferentes. Juntamente com um sequenciamento padronizado protocolo e sequência de análise de fluxo de trabalho que temos anteriormente descrevem40, este método de amostragem permite a análise de sequência até ao nível de gênero. Mais "meta"-estudos, tais como metatranscriptomic ou metabolómica estudos são possíveis baseiam no protocolo de amostragem apresentado neste vídeo.
Passos críticos:
Evitar a contaminação é uma etapa crítica: instrumentos esterilizados têm de ser aplicadas em um ambiente não-estéril na vivo . A transferência da boca para o banco tem de ser realizada rapidamente e firmemente por um examinador experiente para manter o tempo de cadeira para os participantes do estudo tão curtos quanto possível. O passo mais crítico no protocolo é a inserção atraumática do ponto para o sulco subgengival de papel. Ruptura do epitélio juncional e sangramento absolutamente tem que ser evitado. Mais tem que ser tomado para não contaminar pontos de papel e armazenamento frascos com exógeno DNA ou RNA. O armazenamento em seguida também é uma etapa crítica. Precisam de amostras a serem congelados directamente, na melhor das hipóteses, −80 ° C. Isso evita mudanças na amostragem de post composição bacteriana, que iria falsificar resultados de sequenciamento.

Biofilme oral humana é composto por uma ampla comunidade que consiste principalmente de comensais e microorganismos benéficos1,2,3. Espécies encontradas aqui colonizam todos os nichos que a cavidade oral oferece4,5,6. Composição do biofilme nestes nichos varia tão amplamente como os habitats. Saliva, por exemplo, exibe diferentes perfis bacterianas do que amostras de placa. Nas amostras de placa de adultos saudáveis, a abundância relativa de Actinobacteria é mais 20%, enquanto menos de 7% é encontrado na saliva. Bacteroidetes e Firmicutes em contraste aparecem em números muito superiores em saliva7. Assim, é importante a amostra em locais diferentes na boca a fim de obter toda a imagem. Além disso, vários fatores como diferenças étnicas e geográficas, idade, sexo e muitos outros fatores dificultam a identificar as regras gerais de biofilme desenvolvimento e doença início8,9. Por muitos anos, a investigação de periopathogenic e cariogênica biofilme tem sido uma preocupação central8,10,11,12,13.
Nos últimos anos, a pesquisa em indivíduos saudáveis ganhou importância não só para uma compreensão mais ampla da doença, mas também para a implementação de medidas preventivas14. Novas tecnologias e análises moleculares mais elucidar a formação de biofilme oral e função15,16e permitem a criação de perfil completo da diversidade microbiana17,18. Isso é esperado para também levar a uma nova compreensão das mudanças microbianas durante a terapia ortodôntica19. Um impacto sobre o desenvolvimento de biomateriais ortodônticos é previsível. A perspectiva avançada irá lançar nova luz sobre complicações da terapia ortodôntica associada com biofilme, tais como a desmineralização do esmalte e doenças periodontais12,20,21. Para permitir comparações de dados em todo o mundo, é crucial padronizar todas as etapas de geração de dados. Pequenas alterações em procedimentos laboratoriais podem fortemente influenciar os resultados. Além disso, o uso de diferentes plataformas computacionais em processamento de dados pode levar a conjuntos de dados não comparáveis. Por último, a escolha de testes estatísticos e correções tem uma influência sobre os resultados. No entanto, o viés de amostragem já pode ocorrer muito antes de qualquer trabalho de laboratório ou bio-computação começa. Métodos de amostragem não-padronizados originar um estudo inerentemente tendencioso. Tendo em conta a baixa para níveis moderados de padronização nos estudos relevantes, pouca evidência existe na relação entre Ortodontia e microbiomes19. Portanto, o desenvolvimento de métodos padronizados facilitariam qualificado de comparação de dados no campo.
Este artigo apresenta o biofilme oral padronizada procedimentos de amostragem. O protocolo destina-se a contribuir para gerar globalmente comparáveis coleções de dados da sequência microbiana. É apresentado um protocolo passo a passo para amostragem de biofilme oral em crianças saudáveis. Como o método de escolha, pontos de papel são atraumatically inserido no som sulco subgengival. Para facilitar as comparações de habitat, mucosa da bochecha é amostrado de acordo com o mesmo protocolo. Este artigo demonstra adicionalmente amostragem paralela e em pool. Além disso, a colheita de amostras de saliva é mostrada. Um simples código de cores transporte e sistema de armazenamento também é apresentado, facilitando o gerenciamento de amostra para processamento adicional. A escolha das operações a jusante sobre bioinformática, análises de metagenomic e meio de armazenamento depende da clínicas questões levantadas pelos diferentes campos de pesquisa oral. Neste manuscrito, amostragem de DNA para NGS foi escolhida como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1545">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paper Points Taper .02, sterilised</td>
			<td style="width:247px;">VDW Dental</td>
			<td style="width:119px;">550 029 015</td>
			<td style="width:947px;">http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&#38;cHash= 
			1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GC Cocoa Butter, Tube of 10 g</td>
			<td style="width:247px;">GC EUROPE N.V.</td>
			<td style="width:119px;">000387</td>
			<td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Rondells blue</td>
			<td style="width:247px;">DIRECTA AB</td>
			<td>Rondell Tablets</td>
			<td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Great Lakes Nola Dry Field System</td>
			<td style="width:247px;">Great Lakes Ortho</td>
			<td>300-401</td>
			<td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">tooth brush</td>
			<td style="width:247px;">Oral-B</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">micro-Ident plus11</td>
			<td style="width:247px;">Hain Lifescience GmbH</td>
			<td>23312</td>
			<td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ParoCheck</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>460020</td>
			<td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carpegen Perio Diagnostik</td>
			<td style="width:247px;">Carpegen GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">tubes Reaktionsgef&#228;&#223;e 1,5 ml</td>
			<td>Lactan</td>
			<td>CH77.1&#160; to CH81.1</td>
			<td>www.lactan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">cotton swabs</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">9003182</td>
			<td>www.henryschein.at</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children

Biofilme oral e sua análise molecular proporcionam uma base para investigar várias pesquisa odontológica e questões clínicas. Conhecimento da composição do biofilme leva a uma melhor compreensão dos mecanismos cariogênica e periopathogenic. Microbianas mudanças que ocorrem na cavidade oral durante a infância são de interesse por diversas razões. A evolução da criança microbiota oral e mudanças na sua composição precisa ser analisado ainda mais para compreender e possivelmente prevenir o aparecimento da doença. Ao mesmo tempo, é necessário conhecimento avançado de composição natural do biofilme oral. Primeiras fases da dentição permanente cáries com gengivas saudáveis fornecem um habitat subgengival amplamente afetado que pode servir como uma base em situ para estudar características de saúde bucal e doença. Análise de biofilme oral de crianças durante as diferentes fases da vida, portanto, é um tema importante no campo. Métodos de análise molecular moderna podem fornecer informações abrangentes sobre a diversidade bacteriana de tais biofilmes. Para permitir a comparação de dados da microbiota, é importante a padronização de cada etapa do procedimento para geração de dados moleculares. Este procedimento abrange clínico de amostragem, a próxima geração de sequenciamento (NGS), bioinformatic do processamento de dados, a interpretação taxonômica. Um dos fatores mais críticos aqui é amostragem de biofilme. Amostragem em crianças é ainda mais desafiador em particular devido ao espaço limitado em áreas subgengivais. Focalizamos, portanto, o uso de pontos de papel para amostragem subgengival. Este artigo fornece um protocolo detalhado para amostragem de biofilme oral do sulco subgengival, mucosa e saliva em crianças.

Na presente publicação, amostragem de DNA para NGS é demonstrada como um exemplo de uma possível aplicação para pesquisa ortodôntica. ADN bacteriano é extraído diretamente de amostras de papel de ponto. Este DNA pode ser usado em estudos da composição microbiana para clínicas ou perguntas de investigação (como resumidos na Figura 10).
Métodos de análise molecular moderna como o método NGS 454-pyrosequencing dar uma visão geral da microbiota completa de uma amostra. O DNA de milhares de bactérias é identificado simultaneamente em diferentes níveis filogenéticos sobre o 16s diferenças de sequência de RNA ribossomal. Plataformas de Bioinformatic precisam ser gerado como um meio de estruturação em clusters, a informação obtida de grandes conjuntos de dados. Análise estatística pode então ser aplicada a microbiota datasets.
A global relativa abundância de determinadas espécies bacterianas pode ser analisada como podem turnos na microbiota devido a mudanças nas condições de habitat. Gráficos de barras (Figura 11) e heatmaps (Figura 12) exibir a composição bacteriana subgengival no nível de filo ou no nível de ordem. Vários indivíduos e tratamentos podem ser comparados por estatística descritiva e inferencial. Figura 13 apresenta uma comparação histograma dos dois modos de ponto papel subgengival de amostragem em diferentes níveis taxonômicos. A tabela 1 mostra a mudança na composição do biofilme durante um estudo em vitro comparando dois pontos de tempo (T1 e T3). Mudanças estatisticamente significativas foram calculadas com o teste de Wilcoxon rank-assinado e correção de Bonferroni seguir a partir dos dados de 454-pyrosequencing.
Finalmente, análise de coordenadas principais (PCoA) permite comparação 3D direta no nível de unidade taxonômica operacional (OTU) conforme identificado em amostras diferentes. As parcelas de PCoA na Figura 14 exibem diferenças intra e inter individual da microbiome subgengival em uma série de casos de cinco filhos. Figura 15 mostra os resultados de um estudo de caso-controle ortodôntico: rosa para pontos vermelhos são os casos, a luz à obscuridade pontos azuis são os controles, todos incluídos na amostra repetidamente durante um período de quatro meses. Um cluster clara dos casos após a intervenção ortodôntica (pontos vermelhos) representa uma mudança na microbiome. Pontos azuis, representando o grupo de controle, são distribuídos uniformemente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparar pontos de papel de comprimento padronizado. Pontos de papel calibrado estéril são cortados na primeira marca de anel para padronizar o seu comprimento. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg"> 
Figura 2 : Pontos de papel livre de DNA e esterilize. Pontos de papel padronizados são esterilizados e UV irradiados em uma bancada limpa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg"> 
Figura 3 : Inserção de papel subgengival ponto. Pontos de papel calibrado estéril são inseridos tangencialmente ao sulco subgengival até a marca do anel de 4 mm por 20 s.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg"> 
Figura 4 : Corte no papel ponto no tubo. Diretamente após a amostragem, pontos de papel são cortados na terceira marca de anel (4 mm) em uma estéril e livre de DNA 1,5 mL frasco. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg"> 
Figura 5 : Amostragem em pool e paralela. Dois pontos de papel são inseridos simultaneamente ao sulco subgengival de um dente (A) ou vários pontos de papel para os sulcos subgengivais de vários dentes (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg"> 
Figura 6 : Amostragem mucosal. Pontos de papel calibrado estéril são colocados em mucosa da prega vestibular. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg"> 
Figura 7 : Coleta de saliva. Unstimulated saliva é cuspir em um béquer estéril. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg"> 
Figura 8 : Plano de amostragem. As amostras podem ser coletadas como single (lado esquerdo, um dente de cada), pool (várias de todos os matizes em um frasco), ou amostras de paralelo (listras azuis, dois pontos de papel em um dente). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg"> 
Figura 9 : Color-coded armazenamento. Um código de cor referente para folhas e frascos facilita a mais, amostra de manipulação.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg"> 
Figura 10 : Análise do biofilme subgengival. Apresentação esquemática da amostragem de biofilme clínico (A), extração de DNA (B) e diferentes tecnologias NGS (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg"> 
Figura 11 : Gráfico de barras. Mostrando a abundância relativa de bactérias no nível de filo analisados usando 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg"> 
Figura 12 : Heatmap. Mostrando abundâncias relativas das ordens bacterianas analisadas usando 454-pyrosequencing. Vermelho escuro representa uma alta abundância relativa (&#62; 10%). Azul escuro representa uma muito baixa para não abundância relativa da respectiva ordem bacteriana. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg"> 
Figura 13 : Histograma. Comparação de dois modos de papel ponto de amostragem (modos A e B) em diferentes níveis taxonômicos. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg"> 
Figura 14 : 2D enredo PCoA. Uma série de casos (n = 5) mostrando diferenças individuais intra e inter individuais, como resultado de dois métodos de amostragem subgengival (1 cor é 1 tema). Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Santigli et al . 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg"> 
Figura 15 : Instantâneo de uma animação 3D de enredo PCoA. Microbiome subgengival apresentando desloca-se em um estudo de caso-controle ortodôntico (n = 16; cada grupo, 3 pontos no tempo; casos: rosa vermelha, controles: luz para azul escuro). Dados gerados com 454-pyrosequencing.Dados inéditos do grupo de trabalho Santigli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Táxon: Bacteriae</td>
			<td colspan="3">Ponto do tempo 1 [%]</td>
			<td colspan="3">Ponto do tempo 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Teste de Wilcoxon rank-assinado</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Filo/género</td>
			<td>dia 25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75º</td>
			<td>dia 25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75º</td>
			<td>p-valor</td>
			<td>p-valor ajustado #</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1,07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinomyces</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,30</td>
			<td>0,97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dentocariosa</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1,02</td>
			<td>2,44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicutes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (bacilos)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Staphylococcus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Lactobacillales)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Granulicatella</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0.64</td>
			<td>1,59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lactobacilo</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (Streptococcaceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,10</td>
			<td>0,19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0,69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Streptococcus</td>
			<td>53,42</td>
			<td>61.96</td>
			<td>88.38</td>
			<td>48,44</td>
			<td>60.83</td>
			<td>73.97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Outros (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.01</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0.11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Dialister</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.240</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27.15</td>
			<td>42.78</td>
			<td>6,69</td>
			<td>13,38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobactérias</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,00</td>
			<td>0,03</td>
			<td>0.31</td>
			<td>0,84</td>
			<td>2.38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">teste de Wilcoxon assinou-rank # valor p ajustado de acordo com correção de Bonferroni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">Um p &#60; 0.0026 foi considerado significativo</td>
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Tabela 1: Análise estatística. Diferenças na microbiome oral de crianças saudáveis em dois pontos no tempo. Dados gerados com 454-pyrosequencing. Imagem modificada de Klug et al . 23

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Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.

Biofilme oral amostragem para análise de Microbiome em crianças saudáveis

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K visualizações.  Medical University of Graz. Mudanças na microbiome oral ao longo da infância são motivo de crescente interesse. Comparação de diferentes microbiome estudos revela uma falta de protocolos padronizados de amostragem. Espaço limitado faz amostragem do som sulco subgengival de crianças desafiadoras. Papel do ponto de amostragem é apresentada aqui em detalhe como o método de escolha para esta área.

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Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

Análise de biofilme oral de Palatal Expansores por fluorescência de hibridização in situ e microscopia confocal a laser Scanning

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

Medicina

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

VERDADEIRO silenciamento gênico: Triagem de um heptâmero tipo Guia de pequeno RNA Biblioteca de agentes terapêuticos potenciais Câncer

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal model to investigate bladder remodeling in pBOO are female rodents undergoing partial obstruction at the proximal urethra. Variability in the degree of obstruction and animal mortality are major concerns with proximal obstruction. Furthermore, dissecting around the proximal urethra and bladder neck jeopardizes bladder innervation.
We developed a nerve-sparing mid-urethral obstruction (NeMO) model for pBOO avoiding the disadvantages of the traditional model. We approached the urethra just inferior to the pubic symphysis, which obviated the need for laparotomy as well as for dissection in this area; also, the striated urethral sphincter remained untouched. We performed NeMO in female Sprague-Dawley rats (12 obstructions, 6 sham animals) as well as in female C57/bl6 mice (20 obstructions, 18 sham animals). After two weeks, we evaluated bladder function, bladder mass, and body mass.
We had no mortalities among obstructed- or sham-operated female rats; as described for the traditional proximal pBOO-method, we tied the suture around the proximal urethra and a temporarily placed 0.9 mm metal rod. NeMO induced an 85% increase in bladder mass after two weeks, average residual urine volume was 0.4 mL in partially obstructed rats while only 0.03 mL in sham animals. In mice, we tested 3 sizes of cannulas that we placed along the urethra when tying the suture. We found that using a 27-gauge cannula resulted in over 50% animal mortality; placing the 25-gauge cannula did not yield the desired response in increasing bladder mass; utilizing a 26-gauge cannula yielded favorable results with minimal animal mortality (1/8) yet a significant 2-fold increase in bladder mass.

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Traditional modeling of partial bladder outlet obstruction in rodents is fraught with animal mortality. A denervation injury from dissection around the proximal urethra and bladder neck is also of major concern. We developed and evaluated a safe and reliable mid-urethral obstruction model, avoiding the shortcomings of the traditional model.

-Nervo poupadores Mid-obstrução uretral (Nemo) em fêmeas pequenos roedores

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Formação de biofilme oral em diferentes materiais para implantes dentários

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Handheld Metal Detector Screening for Metallic Foreign Body Ingestion in Children

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a handheld metal detector to detect ingested metallic foreign bodies in children. We propose that by introducing handheld metal detector screening early in the triage process of children with high suspicion of metallic foreign body ingestion, the number of radiographs being ordered to localize the metallic foreign body can be reduced in this radio-sensitive population. The study protocol requires the screening of the participants for history of foreign body ingestion and exclusion of patients with respiratory distress or metallic implants. The patient changes to hospital gown and items that could contain metal like eyeglasses, earrings, pendants, and ornaments are removed. The patient is positioned in the center of the room away from other metallic interferences. The working status of the handheld metal detector is first confirmed by eliciting a positive audio-visual signal. Then the screening is done in an erect position with head in extension to expose the neck, from the level of the chin to the level of the hip joint, to cover the anatomical areas from neck to pelvis in a zig-zag manner both anteriorly and posteriorly. A positive audio-visual signal is carefully noted during the scanning for the presence of metallic foreign body. Relevant radiographs are ordered as per the area detected on the metal detector screening. The handheld metal detector was able to precisely identify all the coins among the ingested metallic foreign bodies in our study. The handheld metal detector could not consistently detect non-coin metallic foreign bodies. This protocol demonstrates the accuracy of handheld metal detector in the identification and localization of coins and coin like metallic foreign bodies.

Here, we present a protocol to use the handheld metal detector, to screen for the presence of ingested metallic foreign bodies in children who present to the pediatric emergency medicine department with a history of foreign body ingestion.

Triagem de Detector de metais portátil para ingestão de corpo estranho metálico em crianças

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a ...

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, we describe the protocol for using&#160;an absorbent microneedle-based device, absorbent microbiopsy, for minimally invasive sampling of skin and blood mixture. Our goal is to help facilitate rapid progress in clinical research, the establishment of biomarkers for skin disease and reducing the risk for clinical research participants. In contrast to conventional skin biopsy techniques, the absorbent microbiopsy can be performed within seconds and does not require intensive training due to its simple design. In this report, we describe the use of absorbent microbiopsy, including loading and application, on a&#160;volunteer. Then, we show how to isolate RNA from the absorbed sample. Finally, we demonstrate the use of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to quantify mRNA expression levels of both blood (CD3E and CD19) and skin (KRT14 and TYR). The methods that we describe utilize off the shelf kits and reagents. This protocol offers a minimally invasive approach for simultaneous sampling of skin and blood within the same absorbent microbiopsy matrix. We have found human ethics committees, clinicians and volunteers to be supportive of this approach to dermatological research.

In this article, we demonstrate how the absorbent microbiopsy technique is performed and how the sample can be used for RNA extraction for simple and simultaneous sampling of skin and blood in a minimally invasive manner.

Amostragem Microbiopsy absorvente e extração do RNA para sangue minimamente invasiva, simultânea e análise de pele

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

Virtual Prism Adaptation Therapy: Protocol for Validation in Healthy Adults

Hemispatial neglect is a common impairment after stroke. It is associated with poor functional and social outcomes. Therefore, an adequate intervention is imperative for the successful management of hemispatial neglect. However, the clinical use of various interventions is limited in real clinical practice. Prism adaptation therapy is one of the most evidence-based rehabilitation modalities to treat hemispatial neglect. To overcome any possible shortcoming that may occur with prism therapy, we developed a new system using immersive virtual reality and depth-sensing camera to create a virtual prism adaptation therapy (VPAT). To validate the VPAT system, we designed an experimental protocol investigating the behavioral errors and changes in cortical activation via the VPAT system. Cortical activation was measured by functional near infrared spectroscopy (fNIRS). The experiment consisted of four phases. All four included clicking, pointing or rest applied to right-handed healthy people. Clicking versus pointing was used for investigating the cortical region related with the gross motor task, and pointing with VPAT versus pointing without VPAT was used for investigating the cortical region associated with visuospatial perception. The preliminary results from four healthy participants showed that pointing errors by the VPAT system was similar to the conventional prism adaptation therapy. Further analysis with more participants and fNIRS data, as well as a study in patients with stroke may be required.

This experimental protocol demonstrates the use of virtual prism adaptation therapy (VPAT) in healthy adults and the association between VPAT and functional near infrared spectroscopy to determine the effect of VPAT on cortical activation. Results suggest that VPAT may be feasible and could induce similar behavioral adaptation as conventional prism adaptation therapy.

Terapia de Adaptação virtual de Prisma: Protocolo para Validação em Adultos Saudáveis

Hemispatial neglect is a common impairment after stroke. It is associated with poor functional and social outcomes. Therefore, an adequate intervention is ...

Lower Limb Biomechanical Analysis of Healthy Participants

Biomechanical analysis techniques are useful in the study of human movement. The aim of this study was to introduce a technique for the lower limb biomechanical assessment in healthy participants using commercially available systems. Separate protocols were introduced for the gait analysis and muscle strength testing systems. To ensure maximum accuracy for gait assessment, attention should be given to the marker placements and self-paced treadmill acclimatization time. Similarly, participant positioning, a practice trial, and verbal encouragement are three critical stages in muscle strength testing. The current evidence suggests that the methodology outlined in this article may be effective for the assessment of lower limb biomechanics.

This article introduces a comprehensive experimental methodology on two of the latest technologies available to measure the lower limb biomechanics of individuals.

Análise biomecânica do membro inferior de participantes saudáveis

Biomechanical analysis techniques are useful in the study of human movement. The aim of this study was to introduce a technique for the lower limb ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still in need. In recent years, mass spectrometry has become a method of choice for untargeted profiling of discriminatory compound as potential biomarkers of a disease. Biofluids are generally considered as preferable matrices given their accessibility and easier sample processing while direct tissue profiling provides more selective information about a given cancer. Preparation of tissues for the analysis via traditional methods is much more complex and time-consuming, and, therefore, not suitable for fast on-site analysis. The current work presents a protocol combining sample preparation and extraction of small molecules on-site, immediately after tumor resection. The sampling device, which is of the size of an acupuncture needle, can be inserted directly into the tissue and then transported to the nearby laboratory for instrumental analysis. The results of metabolomics and lipidomics analyses demonstrate the capability of the approach for the establishment of phenotypes of tumors related to the histological origin of the tumor, malignancy, and genetic mutations, as well as for the selection of discriminating compounds or potential biomarkers. The non-destructive nature of the technique permits subsequent performance of routinely used tests e.g., histological tests, on the same samples used for SPME analysis, thus enabling attainment of more comprehensive information to support personalized diagnostics.

The manuscript presents on-site sampling of human brain tumors with solid phase microextraction followed by their biochemical profiling towards the discovery of biomarkers.

Amostragem e Extração de Tumores Cerebrais no local para análise metabolômica e lipidômica

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.