Gli autori sono grati a Joachim Theussl (centro di ricerca medica, Università medica di Graz) per l'eccellente assistenza tecnica nella produzione video e a Monica Farrell (gestione di ricerca, Università medica di Graz) come talento vocale.

Protocollo e riprese video sono state approvate dal comitato di revisione istituzionale dell'Università medica di Graz (Votum 126ex14-15/27). Consenso scritto per la pubblicazione dei video è stato ottenuto da suo padre e il figlio.
1. gli strumenti e materiali
<ol>
	<li>Taglio calibrato (ISO 015/02) e punte di carta sterili, solitamente utilizzati in terapia endodontic, alla prima boa anello al fine di standardizzare la loro lunghezza (Figura 1).</li>
	<li>Applicare l'irradiazione di luce UV a 260 nm per 30 min al fine di evitare la contaminazione del DNA e RNA di punte di carta (Figura 2).</li>
	<li>Autoclave i tubi per l'archiviazione a 120 ° C e 1.2 bar per 20 min e UV-irradiare li pure o impiegano ready-to-use gamma irradiati tubi.</li>
</ol>
2. preparazione di soggetti
Nota: Il consenso informato scritto è stato ottenuto dal bambino e suo padre prima dell'arruolamento.
<ol>
	<li>Applicare burro di cacao per le labbra.</li>
	<li>Montare sulla guancia e lingua riavvolgitore per accesso completo su entrambe le arcate dentali.</li>
	<li>Macchia la placca dentale con divulgazione di placca.</li>
	<li>Rimuovere l'apparecchio di campo asciutto.</li>
	<li>Sciacquare la bocca con acqua fino a quando l'acqua è incolore.</li>
	<li>Spazzolare accuratamente i denti con un spazzolino da denti elettrico presso l'angolazione di 45 °. Applicare acqua solo ma nessun dentifricio, come ciò modificherebbe il biofilm orale.</li>
	<li>Montare l'apparecchio di campo asciutto nuovamente, compresa la guardia di linguetta per mantenere la bocca aperta e asciutta.</li>
	<li>Asciutto e pulito i denti di indice con tamponi di cotone sterile per evitare un assorbimento del fluido sopragengivale durante carta punto di campionamento.</li>
</ol>
3. Biofilm campionamento
<ol>
	<li>Punto di campionamento del solco subgengivale del foglio
	<ol>
		<li>Afferrare i punti di carta con una pinzetta dentale sterile.</li>
		<li>Inserire carta punti tangenzialmente fino a una lunghezza definita di 4 mm. Fare attenzione di non traumatizzare l'epitelio giunzionale (Figura 3).</li>
		<li>Rimuovere la carta punti dopo 20 s.</li>
		<li>Raccogliere punti carta direttamente nelle provette preparate: posizionare la carta punto punta direttamente in un flacone sterile e privo di DNA e tagliarlo al terzo interrogativo ad una lunghezza standard di 4 mm (Figura 4).</li>
		<li>Se indicato dai protocolli di studio, inserire due punti carta parallelamente e simultaneamente nello stesso sito (Figura 5A).</li>
		<li>In alternativa, raccogliere punti carta da diversi siti, se il protocollo di studio richiede "pool di campioni" (figura 5B).</li>
		<li>Rimuovere l'apparecchio di campo asciutto per la mucosa e campionamento di saliva.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Carta della mucosa punto di campionamento
	<ol>
		<li>Applicare i punti di carta per la piega vestibolare della guancica superiore (Figura 6).</li>
		<li>Chiudere la guancia e massaggiare brevemente.</li>
		<li>Aprire la guancia e rimuovere i punti di carta dopo 20 s.</li>
		<li>Tagliare la carta punti al terzo interrogativo e metterli in una provetta sterile come indicato per il campionamento sottogengivale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Campionamento di saliva
	<ol>
		<li>Lasciate che il bambino sputare saliva non stimolata in un recipiente di raccolta sterilizzati (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. trasferimento e deposito
<ol>
	<li>Raccogliere punti carta come campioni singoli, pool o paralleli a seconda del disegno dello studio (Figura 8).</li>
	<li>Applicare un sistema di storage con codifica a colori per facilitare ulteriormente la gestione dei campioni (Figura 9).</li>
	<li>Infine, conservare i campioni a − 80 ° C in attesa di analisi microbioma.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Paster, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Diversity+in+Human+Subgingival+Plaque.">Bacterial Diversity in Human Subgingival Plaque.</a> J Bacteriol. 183 (12), 3770-3783 (2001).</li><li>Aas, J., Paster, B., Stokes, L., Olsen, I., Dewhirst, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Normal+Bacterial+Flora+of+the+Oral+Cavity.">Defining the Normal Bacterial Flora of the Oral Cavity.</a> J Clin Microbiol. 43 (11), 5721-5732 (2005).</li><li>Ledder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Analysis+of+the+Subgingival+Microbiota+in+Health+and+Disease.">Molecular Analysis of the Subgingival Microbiota in Health and Disease.</a> Appl Environ Microb. 73 (2), 516-523 (2007).</li><li>Zaura, E., Keijser, B., Huse, S., Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+healthy+'core+microbiome'+of+oral+microbial+communities.">Defining the healthy 'core microbiome' of oral microbial communities.</a> BMC Microbiol. 9 (259), 1-12 (2009).</li><li>Alcaraz, L. 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Gli autori non segnalano conflitti di interesse relazionati a questa produzione scientifica dei video.

Batteri si trovano in tutti i siti all'interno della cavità orale24,25,26. Molti studi si sono concentrati sull'uso di saliva come mezzo di campionamento per mappare la colonizzazione orale come si può facilmente essere provato attraverso sputando27,28,29,30,31, 32. Tuttavia, biofilm salivare non riflette biofilm subgengivale composizione. Così, l'uso di altri metodi di campionamento è cruciale per la creazione di tutta l'immagine e si evoca nuove discussioni nella ricerca dentale. Diversi articoli confrontare l'uso di Curette e punte di carta per il prelievo sottogengivale di soggetti periodontally malate8,33,34. Ancora nessun gruppo di ricerca è noto si sono concentrati sull'applicazione di dispositivi di campionamento standardizzato per diverse fasce di età, soprattutto per i bambini19.
In questo video, campionamento di biofilm orali di tre habitat orale nei bambini sani è presentato.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
L'obiettivo del manoscritto si concentra sul protocollo clinico per il campionamento di biofilm subgengivale di bambini sani. Il metodo di scelta si riferisce al suoni sulci subgingival dove lo spazio limitato rende particolarmente impegnativo di campionamento. In questo video il metodo è stato applicato alla precoce dentizione permanente. Può anche essere applicato alla dentizione mista o matura e a bambini e adulti. Il nostro metodo di campionamento consente di effettuare modifiche ad esempio campioni singoli o pooled. Quest'ultimo potrebbe diventare un fattore cruciale per analisi molecolari a causa della piccola quantità di DNA da collezione dal solco subgengivale sano. La scelta dei denti indice può essere modificata su richiesta; in particolare, un altro dente può essere campionate in alternativa quando l'epitelio è traumatizzata e sanguinamento, rendendo così il punto di carta inutilizzabile. Campionamento parallelo utilizzando due punti di carta contemporaneamente in un unico sito rende campione replicati in un unico passaggio, oltre ad abbreviare i tempi di sedia per bambini.
Con lievi modifiche si possono campionare malate tasche parodontali. Qui punte di carta dovrà essere inserito per l'intera lunghezza della tasca, che può raggiungere fino a 10 mm. La lunghezza e il cono di punte di carta così come la profondità di inserimento deve essere adattato all'habitat intraoral di interesse, ma dovrebbe sempre essere standardizzata di materiale e dimensioni. Campioni possono essere prelevati anche dalla mucosa usando punte di carta. Protocolli identici consentono comparazioni di diversi habitat orale e vari materiali dentali. Preparazione del paziente e conservazione dei campioni può essere eseguite come descritto in questo video. Per la ricerca di metatranscriptome, RNA potrebbe essere campionato con lo stesso metodo. Così, dopo il campionamento, i punti di carta devono essere inseriti direttamente nella soluzione di stabilizzazione di RNA.
Limiti della tecnica:
Indipendentemente dalle modifiche, il metodo di campionamento clinica che descriviamo è limitato a solco subgengivale suono. Altri siti di campionamento, per quanto riguarda tasche periodontally malate di esempio, non facevano parte del nostro studio di design. Come campionamento per tutta la profondità di queste tasche è necessaria, punte di carta potrebbero non essere abbastanza grande per raccogliere campioni sufficientemente. Se l'obiettivo sperimentale è quello di confrontare i dati acquisiti dal suoni subgingival solchi e tasche periodontally malate, è importante da tenere presente il pregiudizio inerente che è associato con metodi di campionamento clinici differenti. Non è pertanto consigliabile confrontare tali dati.
Una limitazione del metodo qui presentato è campionamento senza l'uso successivo di propidio monoazide. L'aggiunta di questo agente direttamente dopo il campionamento consente un'analisi specifica delle cellule viventi solo nel biofilm analizzati. Il metodo di campionamento descritto qui riflette il numero di cellule vive e morte. Per la ricerca di periodontitis severo, punte di carta probabilmente bisogno essere sostituito da curette, come formazione di biofilm in tasche profonde è forte. Punto di campionamento potrebbe non riflettere l'intero spettro microbico in questi casi, come la loro superficie della carta potrebbe essere saturo troppo in fretta.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:
Il manoscritto proposto è il primo del suo genere per standardizzare subgingival campionamento nel solco sano con punte di carta. Altri rapporti hanno fatto riferimento all'uso del metallo Curette35,36 o carta punti 37,38,39, ma non ha descritto i processi che si svolgono prima del campionamento, tali come controllo della placca, denti pulizia, isolamento del dente e asciugatura, così come i processi che derivano da specifiche inadeguate su linee di tecnica e tempo di campionamento.
In due articoli precedenti, indichiamo che l'uso di punte di carta è un metodo riproducibile per il campionamento di biofilm subgengivale in bambini22,40. Grazie al loro design, Curette sono troppo grandi per il solco poco profondo con spazio limitato e troppo forte per l'epitelio giunzionale tenera. È fondamentale accedere il solco subgengivale senza traumatizzare l'epitelio. In questo modo, si evita pregiudizi derivanti da sanguinamento. Così, l'uso dei punti di carta sottile e tenera è preferito per questa zona. Punte di carta sono funzionali per monitorare i cambiamenti nella composizione di biofilm durante il trattamento ortodontico21,41. Sono sottile e sufficientemente flessibile per adattarsi tra gli elementi di apparecchi ortodontici fissi. Questo è un grande vantaggio ad altri metodi di campionamento come Curette. Atraumatic campionamento è semplificata e campionamento di piccole quantità di DNA è possibile.
Future applicazioni:
In questo video abbiamo dimostrato il metodo sulla dentatura non malate, precoce, permanente. Può essere applicato anche alla dentizione mista o matura. Con alcuni adattamenti è possibile assaggiare periodontally malate siti come i denti o gli impianti e altre nicchie a causa di materiali dentali seguendo lo stesso protocollo. Ricerca della carie potrebbe beneficiare di questo protocollo standardizzato, in particolare studi sulla carie della radice. La lezione più importante dalla nostra campionatura dei video è la standardizzazione dei protocolli per rendere i dati comparabili, non importa che cosa e come campioni sono misurati.Dimostrazioni video future potrebbero migliorare il campo di campionamento clinico in generale.
Biofilm orali ottenute come mostrato nel video è utilizzato nelle cliniche e per le indagini scientifiche. Questo approccio in vivo rappresenta una buona aggiunta in vitro tecniche molecolari come l'ibridazione in situ di fluorescenza e microscopia15di scansione laser confocale. Metodi NGS, come il pirosequenziamento riportato di seguito, applicato a biofilm raccolti, permettono l'analisi del microbiota completo. Calcolare l'abbondanza relativa di determinate specie batteriche può essere utilizzato per sostenere i trattamenti o per confrontare diversi pazienti o trattamenti diversi. Insieme a un workflow di analisi protocollo e sequenza di sequenziamento standardizzati che abbiamo precedentemente descritto40, questo metodo di campionamento permette l'analisi di sequenza fino al livello di genere. Maggiori "meta"-studi come metatranscriptomic o metabolomico studi sono possibili basano sul protocollo di campionamento presentato in questo video.
Fasi critiche:
Evitando la contaminazione è un passaggio fondamentale: strumenti sterili devono essere applicate in un ambiente non sterile in vivo . Il trasferimento dalla bocca al banco deve essere effettuata rapidamente e in modo sicuro da un esaminatore esperto per mantenere la durata della seduta per i partecipanti di studio più brevi possibile. La fase più critica nel protocollo è l'inserimento atraumatico del punto di carta dentro il solco subgengivale. Rottura dell'epitelio giunzionale e sanguinamento assolutamente devono essere evitate. Ulteriore cura deve essere presa al fine di non contaminare carta punti e stoccaggio fiale con RNA o DNA esogeno. Il deposito quindi è anche un passo fondamentale. I campioni devono essere congelati direttamente, nella migliore delle ipotesi a − 80 ° C. Questo evita modifiche nel campionamento post composizione batterica, che falsificherebbe risultati di sequenziamento.

Biofilm orale umana comprende una vasta comunità composta prevalentemente da commensali e microrganismi benefici1,2,3. Specie che si trovano qui colonizzare tutte le nicchie che la cavità orale offre4,5,6. Composizione di biofilm in queste nicchie varia ampiamente quanto gli habitat. Saliva, ad esempio, Visualizza diversi profili batterici rispetto a campioni di placca. In campioni di placca di adulti in buona salute, l'abbondanza relativa di Actinobacteria è oltre 20%, mentre meno del 7% si trova nella saliva. Bacteroidetes e Firmicutes al contrario appaiono in numero molto più elevato in saliva7. Pertanto, è importante per esempio alle posizioni differenti in bocca al fine di ottenere l'intera immagine. Inoltre, diversi fattori quali le differenze geografiche ed etniche, età, sesso e molti altri fattori rendono difficile identificare regole generali per biofilm sviluppo e malattia inizio8,9. Per molti anni l'indagine di parodontopatogene e cariogeni biofilm è stata una preoccupazione centrale8,10,11,12,13.
Negli ultimi anni, la ricerca su soggetti sani ha acquisito importanza non solo per una più ampia comprensione della malattia, ma anche per l'attuazione di misure preventive14. Nuove tecnologie e analisi molecolari ulteriormente delucidare la formazione di biofilm orali e funzione15,16e abilitare la profilatura completa di diversità microbica17,18. Questo dovrebbe portare anche a una nuova comprensione delle modifiche microbiche durante la terapia ortodontica19. Un impatto sullo sviluppo di Biomateriali ortodontici è prevedibile. La prospettiva avanzata verrà gettato nuova luce sulle complicazioni della terapia ortodontica associata a biofilm, come la demineralizzazione dello smalto e malattie parodontali12,20,21. Per consentire il confronto dei dati in tutto il mondo, è fondamentale per standardizzare tutti i passaggi nella generazione dei dati. Piccole modifiche nelle procedure di laboratorio possono influenzare fortemente i risultati. Inoltre, l'uso di diverse piattaforme di calcolo nell'elaborazione dei dati può portare ai set di dati non comparabili. Infine, la scelta dei test statistici e correzioni ha un'influenza sui risultati. Tuttavia, bias di campionamento può verificarsi già a lungo prima di qualsiasi lavoro di laboratorio o inizia la bio-informatica. Metodi di campionamento non standardizzate portano ad uno studio di inerentemente polarizzato. In considerazione del basso a livelli moderati di standardizzazione negli studi, poca prova esiste sul rapporto tra ortodonzia e microbiomi19. Di conseguenza, lo sviluppo di metodi standardizzati faciliterebbe qualificato confronto dei dati nel campo.
Questo articolo presenta biofilm orale standardizzato le procedure di campionamento. Il protocollo è destinato a contribuire a generare globalmente paragonabile collezioni di dati di sequenza microbica. È presentato un protocollo passo-passo per il campionamento di biofilm orali in bambini sani. Come il metodo di scelta, punte di carta sono inserito atraumatically nel solco subgengivale suono. Per facilitare i confronti habitat, mucosa guancia è prelevata secondo lo stesso protocollo. Questo articolo viene illustrato inoltre campionamento parallelo e pool. Inoltre, è dimostrato campione di saliva. Un semplice color-coded trasporto e sistema di archiviazione viene presentato, facilitare la gestione dei campioni per l'ulteriore elaborazione. La scelta delle operazioni a valle per quanto riguarda il supporto di archiviazione, analisi metagenomica e bioinformatica dipende da questioni cliniche di diversi ambiti della ricerca orale. In questo manoscritto, campionamento del DNA per NGS è stato scelto come esempio di una possibile applicazione per la ricerca ortodontico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1545">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Paper Points Taper .02, sterilised</td>
			<td style="width:247px;">VDW Dental</td>
			<td style="width:119px;">550 029 015</td>
			<td style="width:947px;">http://www.vdw-dental.com/en/products/root-canal-drying/paper-points.html?seminarNo=24&#38;cHash= 
			1107d79ab05653b454fd90a954dc92e2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GC Cocoa Butter, Tube of 10 g</td>
			<td style="width:247px;">GC EUROPE N.V.</td>
			<td style="width:119px;">000387</td>
			<td>http://www.gceurope.com/products/detail.php?id=22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Rondells blue</td>
			<td style="width:247px;">DIRECTA AB</td>
			<td>Rondell Tablets</td>
			<td>http://www.directadental.com/exego.aspx?p_id=767</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">Great Lakes Nola Dry Field System</td>
			<td style="width:247px;">Great Lakes Ortho</td>
			<td>300-401</td>
			<td>http://www.greatlakesortho.com/commerce/detail/?nPID=1626</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">tooth brush</td>
			<td style="width:247px;">Oral-B</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.oralb-blendamed.de/de-DE/pro</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">micro-Ident plus11</td>
			<td style="width:247px;">Hain Lifescience GmbH</td>
			<td>23312</td>
			<td>http://www.hain-lifescience.de/en/products/microbiology/dental-diagnostics/micro-ident-und-micro-identplus.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">ParoCheck</td>
			<td style="width:247px;">Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>460020</td>
			<td>https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0150_00020/12705/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carpegen Perio Diagnostik</td>
			<td style="width:247px;">Carpegen GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.carpegen.de/en/products-and-services/carpegen-perio-diagnostics.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">tubes Reaktionsgef&#228;&#223;e 1,5 ml</td>
			<td>Lactan</td>
			<td>CH77.1&#160; to CH81.1</td>
			<td>www.lactan</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:233px;">cotton swabs</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td style="width:119px;">9003182</td>
			<td>www.henryschein.at</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oral biofilm sampling for microbiome analysis in healthy children

Biofilm orali e la sua analisi molecolari forniscono una base per indagare vari dental research e quesiti clinici. Conoscenza della composizione di biofilm conduce ad una migliore comprensione dei meccanismi cariogeni e parodontopatogene. Microbici cambiamenti che avvengono nella cavità orale durante l'infanzia sono di interesse per diversi motivi. L'evoluzione del microbiota orale bambino e cambiamenti nella sua composizione devono essere ulteriormente analizzati per capire e possibilmente prevenire l'insorgenza della malattia. Allo stesso tempo, è necessaria la conoscenza avanzata della composizione naturale dei biofilm orali. Prime fasi della dentizione permanente niente carie con gengive sane forniscono un habitat subgingival ampiamente inalterato che può servire come una previsione in situ per lo studio delle caratteristiche di salute orale e malattia. Analisi del biofilm orali dei bambini durante le diverse fasi nella vita sono dunque un tema importante nel campo. Metodi di analisi molecolare moderna possono fornire informazioni complete circa la diversità batterica di tali biofilm. Per consentire il confronto di dati di microbiota, è importante standardizzare ogni passaggio della procedura per la generazione di dati molecolari. Questa procedura si estende dall'elaborazione dei dati di campionamento clinica, Next Generation Sequencing (NGS), bioinformatica, interpretazione tassonomica. Uno dei fattori più critici qui è il campionamento di biofilm. Campionamento in bambini è ancora più difficile in particolare a causa di spazio limitato nelle aree sottogengivale. Così ci concentriamo sull'uso di punte di carta per il campionamento sottogengivale. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per il campionamento di biofilm orali del solco subgengivale, mucosa e saliva in bambini.

Nella presente pubblicazione, campione di DNA per NGS è ha dimostrato come un esempio di una possibile applicazione per la ricerca ortodontico. DNA batterico è estratta direttamente dai campioni di punto di carta. Questo DNA quindi può essere utilizzato negli studi della composizione microbica per cliniche o domande di ricerca (come sintetizzato nella Figura 10).
Metodi di analisi molecolare moderna come il metodo NGS 454-pyrosequencing dare una panoramica del microbiota completa di un campione. Il DNA di migliaia di batteri è identificato simultaneamente a diversi livelli filogenetici sopra il 16s differenze di sequenza del rRNA. Bioinformatic piattaforme devono essere generati come mezzo di strutturazione in cluster le informazioni recuperate da grandi insiemi di dati. Analisi statistica può quindi applicarsi ai DataSet microbiota.
L'abbondanza relativa complessiva di talune specie batteriche possa essere analizzato come possono turni nel microbiota a causa di cambiamenti delle condizioni di habitat. Grafici a barre (Figura 11) e heatmaps (Figura 12) è necessario visualizzare la composizione batterica subgingival phylum livello o a livello di ordine. Vari individui e trattamenti possono essere confrontati in base statistica descrittiva e inferenziale. Figura 13 presenta un confronto istogramma delle due modalità di punta di carta sottogengivale di campionamento a diversi livelli tassonomici. La tabella 1 Mostra il cambiamento nella composizione di biofilm durante uno studio in vitro che confronta due intervalli di tempo (T1 e T3). Variazioni statisticamente significative sono state calcolate con test di Wilcoxon firmare-allinea e seguente correzione di Bonferroni dai dati pyrosequencing 454.
Infine, analisi delle Coordinate principali (PCoA) consente a confronto diretto 3D a livello di unità operativa tassonomica (fuori) come identificato in diversi campioni. Le trame di PCoA nella Figura 14 visualizzare differenze intra - e inter - specifico del microbioma subgingival in una serie di caso di cinque figli. Figura 15 Mostra i risultati di uno studio caso-controllo ortodontico: rosa a puntini rossi sono i casi, puntini blu chiaro allo scuro sono i controlli, tutti i campionati più volte nel corso di un periodo di quattro mesi. Un chiaro clustering dei casi dopo l'intervento ortodontico (punti rossi) rappresenta una svolta nel microbioma. Puntini blu, che rappresenta il gruppo di controllo, sono distribuiti uniformemente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig1.jpg"> 
Figura 1 : Preparare le punte di carta di lunghezza standardizzata. Punte di carta calibrata sterile sono tagliati alla prima boa anello per standardizzare la loro lunghezza. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig2.jpg"> 
Figura 2 : Carta libera punti dal DNA e sterilizzare. Punte di carta standardizzati sono sterilizzati e UV irradiati in un banco di lavoro pulito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig3.jpg"> 
Figura 3 : Inserimento punto carta subgingival. Sono inseriti tangenzialmente sterile calibrata carta punti nel solco subgengivale fino al contrassegno di anello 4 mm per 20 s.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig4.jpg"> 
Figura 4 : Carta di taglio nel tubo. Direttamente dopo il campionamento, punte di carta vengono tagliati al terzo anello di taratura (4 mm) in una sterile e privo di DNA fiala di 1,5 mL. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig5.jpg"> 
Figura 5 : Campionamento aggregata e parallelo. Due punti di carta vengono inseriti contemporaneamente nel solco sottogengivale di un dente (A) o di alcuni punti di carta ai solchi sottogengivali di parecchi denti (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig6.jpg"> 
Figura 6 : Campionamento mucoso. Punte di carta calibrata sterile vengono deposte nella mucosa della piega vestibolare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig7.jpg"> 
Figura 7 : Raccolta di saliva. In un becher sterile è sputare saliva non stimolata. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig8.jpg"> 
Figura 8 : Schema di campionamento. I campioni possono essere raccolti come singolo (lato sinistro, un dente ogni), pool (diversi per tutte le strisce in un flaconcino), o campioni di parallelo (strisce blu, due punte di carta a un dente). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig9.jpg"> 
Figura 9 : Color-coded deposito. Un codice di colore del rinvio per fogli e fiale facilita ulteriore esempio manipolazione.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig10.jpg"> 
Figura 10 : Analisi di biofilm subgengivale. Presentazione schematica di campionamento clinica biofilm (A), estrazione del DNA (B) e diverse tecnologie NGS (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig10large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig11.jpg"> 
Figura 11 : Grafico a barre. Mostrando la relativa abbondanza di batteri a livello di phylum analizzati usando pyrosequencing 454. Immagine modificata da Santigli et al. 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig11large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig12.jpg"> 
Figura 12 : Heatmap. Risultati relative abbondanze degli ordini batterici analizzati usando pyrosequencing 454. Rosso scuro rappresenta una relativa abbondanza alta (&#62; 10%). Blu scuro rappresenta un molto basso a nessun abbondanza relativa del rispettivo ordine batterica. Immagine modificata da Santigli et al. 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig12large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig13.jpg"> 
Figura 13 : Istogramma. Confronto tra le due modalità di carta punto di campionamento (modi A e B) a diversi livelli tassonomici. Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Santigli et al. 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig13large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig14.jpg"> 
Figura 14 : 2D PCoA trama. Una serie di casi (n = 5) mostrando differenze inter-individuali e intra-individuale a seguito di due metodi di campionamento sottogengivale (1 colore è 1 soggetto). Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Santigli et al. 22 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig14large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56320/56320fig15.jpg"> 
Figura 15 : Istantanea di un'animazione 3D della trama PCoA. Visualizzando subgingival microbiome sposta in uno studio caso-controllo ortodontico (n = 16; ogni gruppo, 3 punti in tempo; casi: dal rosa al rossi, controlli: luce blu scuro). Dati generati con 454-pirosequenziamento.Dati non pubblicati dal gruppo di lavoro Santigli. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56320/56320fig15large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Taxon: immunitŕ</td>
			<td colspan="3">Punto nel tempo 1 [%]</td>
			<td colspan="3">Punto di tempo 3 [%]</td>
			<td colspan="2">Wilcoxon firmare-allinea la prova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Phylum/genere</td>
			<td>25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75th</td>
			<td>25</td>
			<td>Median</td>
			<td>75th</td>
			<td>valore di p</td>
			<td>p-valore registrato n.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Altri</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Altri</td>
			<td>0.70</td>
			<td>1.07</td>
			<td>1.28</td>
			<td>1.32</td>
			<td>1.63</td>
			<td>1.93</td>
			<td>.000</td>
			<td>.005</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Actinomyces</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0.30</td>
			<td>0,97</td>
			<td>.001</td>
			<td>.021</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Rothia</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.05</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0,32</td>
			<td>.001</td>
			<td>.009</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Bacteroidetes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Prevotella</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.22</td>
			<td>0.15</td>
			<td>1.02</td>
			<td>2,44</td>
			<td>.000</td>
			<td>.006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Firmicutes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Altro (Bacilli)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0,06</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>.706</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Stafilococco</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0,17</td>
			<td>.548</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Gemellaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.07</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,77</td>
			<td>1.24</td>
			<td>.005</td>
			<td>.091</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Lactobacillales)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.12</td>
			<td>1.50</td>
			<td>.004</td>
			<td>.073</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Endocardite</td>
			<td>0,09</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0,64</td>
			<td>1.59</td>
			<td>2.28</td>
			<td>.000</td>
			<td>.003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Lactobacillus</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.18</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>.700</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Altro (Streptococcaceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0,19</td>
			<td>.768</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">(Streptococcaceae)</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.10</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0,37</td>
			<td>0,69</td>
			<td>.005</td>
			<td>.083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Streptococco</td>
			<td>53,42</td>
			<td>61,96</td>
			<td>88,38</td>
			<td>48.44</td>
			<td>60,83</td>
			<td>73,97</td>
			<td>.055</td>
			<td>.930</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Altro (Lachnospiraceae)</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,01</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,11</td>
			<td>.003</td>
			<td>.058</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pneumosintes</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,04</td>
			<td>,240</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Veillonella</td>
			<td>3.43</td>
			<td>27,15</td>
			<td>42,78</td>
			<td>6.69</td>
			<td>13,38</td>
			<td>27.05</td>
			<td>.157</td>
			<td>1.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Proteobacteria</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Haemophilus</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0.00</td>
			<td>0,03</td>
			<td>0,31</td>
			<td>0.84</td>
			<td>2,38</td>
			<td>.000</td>
			<td>.008</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">test di Wilcoxon firmare-allinea valore di p # regolata secondo la correzione di Bonferroni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="10">Un p &#60; 0,0026 è stato considerato significativo</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Analisi statistica. Differenze nel microbioma orale di bambini sani in due punti nel tempo. Dati generati con 454-pirosequenziamento. Immagine modificata da Klug et al. 23

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Oral Biofilm Sampling for Microbiome Analysis in Healthy Children

Cambiamenti nel microbioma orale per tutta l'infanzia sono di crescente interesse. Confronto tra diversi microbiome studi rivela una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Spazio limitato rende il solco subgengivale suono dei bambini impegnativi di campionamento. Carta del punto di campionamento è presentato qui in dettaglio come il metodo di scelta per questa zona.

Biofilm orali campionamento per l'analisi di Microbiome nei bambini sani

Oral biofilm and its molecular analysis provide a basis for investigating various dental research and clinical questions. Knowledge of biofilm composition ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Views.  Medical University of Graz. Cambiamenti nel microbioma orale per tutta l'infanzia sono di crescente interesse. Confronto tra diversi microbiome studi rivela una mancanza di protocolli di campionamento standardizzati. Spazio limitato rende il solco subgengivale suono dei bambini impegnativi di campionamento. Carta del punto di campionamento è presentato qui in dettaglio come il metodo di scelta per questa zona.

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Oral Biofilm Analysis of Palatal Expanders by Fluorescence In-Situ Hybridization and Confocal Laser Scanning Microscopy

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of them being fluorescence in situ hybridization (FISH).1,2 We performed a pilot study in which oral biofilm samples collected from fixed orthodontic appliances (palatal expanders) were stained by FISH, the objective being to assess the three-dimensional organization of natural biofilm and plaque accumulation.3,4 FISH creates an opportunity to stain cells in their native biofilm environment by the use of fluorescently labeled 16S rRNA-targeting probes.4-7,19 Compared to alternative techniques like immunofluorescent labeling, this is an inexpensive, precise and straightforward labeling technique to investigate different bacterial groups in mixed biofilm consortia.18,20 General probes were used that bind to Eubacteria (EUB338 + EUB338II + EUB338III; hereafter EUBmix),8-10 Firmicutes (LGC354 A-C; hereafter LGCmix),9,10 and Bacteroidetes (Bac303).11 In addition, specific probes binding to Streptococcus mutans (MUT590)12,13 and Porphyromonas gingivalis (POGI)13,14 were used. The extreme hardness of the surface materials involved (stainless steel and acrylic resin) compelled us to find new ways of preparing the biofilm. As these surface materials could not be readily cut with a cryotome, various sampling methods were explored to obtain intact oral biofilm. The most workable of these approaches is presented in this communication. Small flakes of the biofilm-carrying acrylic resin were scraped off with a sterile scalpel, taking care not to damage the biofilm structure. Forceps were used to collect biofilm from the steel surfaces. Once collected, the samples were fixed and placed directly on polysine coated glass slides. FISH was performed directly on these slides with the probes mentioned above. Various FISH protocols were combined and modified to create a new protocol that was easy to handle.5,10,14,15 Subsequently the samples were analyzed by confocal laser scanning microscopy. Well-known configurations3,4,16,17 could be visualized, including mushroom-style formations and clusters of coccoid bacteria pervaded by channels. In addition, the bacterial composition of these typical biofilm structures were analyzed and 2D and 3D images created.

We present a protocol for structural and compositional analysis of natural oral biofilm from orthodontic appliances with in situ hybridization (FISH) and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Oral biofilm samples were collected from palatal expanders, scraping acrylic-resin flakes off their surface and referring them for molecular processing.

Analisi biofilm orale di espansori palatali da Fluorescence In Situ-ibridazione e microscopia confocale a scansione laser

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of natural heterogeneous biofilm is today facilitated by a comprehensive range of staining techniques, one of ...

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Medicina

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal model to investigate bladder remodeling in pBOO are female rodents undergoing partial obstruction at the proximal urethra. Variability in the degree of obstruction and animal mortality are major concerns with proximal obstruction. Furthermore, dissecting around the proximal urethra and bladder neck jeopardizes bladder innervation.
We developed a nerve-sparing mid-urethral obstruction (NeMO) model for pBOO avoiding the disadvantages of the traditional model. We approached the urethra just inferior to the pubic symphysis, which obviated the need for laparotomy as well as for dissection in this area; also, the striated urethral sphincter remained untouched. We performed NeMO in female Sprague-Dawley rats (12 obstructions, 6 sham animals) as well as in female C57/bl6 mice (20 obstructions, 18 sham animals). After two weeks, we evaluated bladder function, bladder mass, and body mass.
We had no mortalities among obstructed- or sham-operated female rats; as described for the traditional proximal pBOO-method, we tied the suture around the proximal urethra and a temporarily placed 0.9 mm metal rod. NeMO induced an 85% increase in bladder mass after two weeks, average residual urine volume was 0.4 mL in partially obstructed rats while only 0.03 mL in sham animals. In mice, we tested 3 sizes of cannulas that we placed along the urethra when tying the suture. We found that using a 27-gauge cannula resulted in over 50% animal mortality; placing the 25-gauge cannula did not yield the desired response in increasing bladder mass; utilizing a 26-gauge cannula yielded favorable results with minimal animal mortality (1/8) yet a significant 2-fold increase in bladder mass.

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Traditional modeling of partial bladder outlet obstruction in rodents is fraught with animal mortality. A denervation injury from dissection around the proximal urethra and bladder neck is also of major concern. We developed and evaluated a safe and reliable mid-urethral obstruction model, avoiding the shortcomings of the traditional model.

Nerve-sparing Mid-ostruzione uretrale (Nemo) nel femminile piccoli roditori

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low microbial adhesion may reduce the prevalence and progression of peri-implant diseases. In view of the oral environment complexity and oral biofilm heterogeneity, microscopy techniques are needed that can enable a biofilm analysis of the surfaces of teeth and dental materials. This article describes a series of protocols implemented for comparing oral biofilm formation on titanium and ceramic materials for prosthetic abutments, as well as the methods involved in oral biofilms analyses at the morphological and cellular levels. The in situ model to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments as described in this study provides a satisfactory preservation of the 48 h biofilm, thereby demonstrating methodological adequacy. Multiphoton microscopy allows the analysis of an area representative of the biofilm formed on the test materials. In addition, the use of fluorophores and the processing of the images using multiphoton microscopy allows the analysis of the bacterial viability in a very heterogeneous population of microorganisms. The preparation of biological specimens for electron microscopy promotes the structural preservation of biofilm, images with good resolution, and no artifacts.

Here, we present a protocol to evaluate oral biofilm formation on titanium and zirconia materials for dental prosthesis abutments, including the analysis of bacterial cells viability and morphological characteristics. An in situ model associated with powerful microscopy techniques is used for the oral biofilm analysis.

Formazione di Biofilm orali su differenti materiali per impianti dentali

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

Handheld Metal Detector Screening for Metallic Foreign Body Ingestion in Children

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a handheld metal detector to detect ingested metallic foreign bodies in children. We propose that by introducing handheld metal detector screening early in the triage process of children with high suspicion of metallic foreign body ingestion, the number of radiographs being ordered to localize the metallic foreign body can be reduced in this radio-sensitive population. The study protocol requires the screening of the participants for history of foreign body ingestion and exclusion of patients with respiratory distress or metallic implants. The patient changes to hospital gown and items that could contain metal like eyeglasses, earrings, pendants, and ornaments are removed. The patient is positioned in the center of the room away from other metallic interferences. The working status of the handheld metal detector is first confirmed by eliciting a positive audio-visual signal. Then the screening is done in an erect position with head in extension to expose the neck, from the level of the chin to the level of the hip joint, to cover the anatomical areas from neck to pelvis in a zig-zag manner both anteriorly and posteriorly. A positive audio-visual signal is carefully noted during the scanning for the presence of metallic foreign body. Relevant radiographs are ordered as per the area detected on the metal detector screening. The handheld metal detector was able to precisely identify all the coins among the ingested metallic foreign bodies in our study. The handheld metal detector could not consistently detect non-coin metallic foreign bodies. This protocol demonstrates the accuracy of handheld metal detector in the identification and localization of coins and coin like metallic foreign bodies.

Here, we present a protocol to use the handheld metal detector, to screen for the presence of ingested metallic foreign bodies in children who present to the pediatric emergency medicine department with a history of foreign body ingestion.

Metal Detector palmare Screening per ingestione di corpo estraneo metallico nei bambini

Coins are the most common ingested metallic foreign bodies among children. The goal of this protocol is to assess the accuracy and feasibility of using a ...

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, we describe the protocol for using&#160;an absorbent microneedle-based device, absorbent microbiopsy, for minimally invasive sampling of skin and blood mixture. Our goal is to help facilitate rapid progress in clinical research, the establishment of biomarkers for skin disease and reducing the risk for clinical research participants. In contrast to conventional skin biopsy techniques, the absorbent microbiopsy can be performed within seconds and does not require intensive training due to its simple design. In this report, we describe the use of absorbent microbiopsy, including loading and application, on a&#160;volunteer. Then, we show how to isolate RNA from the absorbed sample. Finally, we demonstrate the use of quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) to quantify mRNA expression levels of both blood (CD3E and CD19) and skin (KRT14 and TYR). The methods that we describe utilize off the shelf kits and reagents. This protocol offers a minimally invasive approach for simultaneous sampling of skin and blood within the same absorbent microbiopsy matrix. We have found human ethics committees, clinicians and volunteers to be supportive of this approach to dermatological research.

In this article, we demonstrate how the absorbent microbiopsy technique is performed and how the sample can be used for RNA extraction for simple and simultaneous sampling of skin and blood in a minimally invasive manner.

Microbiopsy assorbente campionamento ed estrazione di RNA per sangue mininvasivo, simultaneo e analisi della pelle

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

Virtual Prism Adaptation Therapy: Protocol for Validation in Healthy Adults

Hemispatial neglect is a common impairment after stroke. It is associated with poor functional and social outcomes. Therefore, an adequate intervention is imperative for the successful management of hemispatial neglect. However, the clinical use of various interventions is limited in real clinical practice. Prism adaptation therapy is one of the most evidence-based rehabilitation modalities to treat hemispatial neglect. To overcome any possible shortcoming that may occur with prism therapy, we developed a new system using immersive virtual reality and depth-sensing camera to create a virtual prism adaptation therapy (VPAT). To validate the VPAT system, we designed an experimental protocol investigating the behavioral errors and changes in cortical activation via the VPAT system. Cortical activation was measured by functional near infrared spectroscopy (fNIRS). The experiment consisted of four phases. All four included clicking, pointing or rest applied to right-handed healthy people. Clicking versus pointing was used for investigating the cortical region related with the gross motor task, and pointing with VPAT versus pointing without VPAT was used for investigating the cortical region associated with visuospatial perception. The preliminary results from four healthy participants showed that pointing errors by the VPAT system was similar to the conventional prism adaptation therapy. Further analysis with more participants and fNIRS data, as well as a study in patients with stroke may be required.

This experimental protocol demonstrates the use of virtual prism adaptation therapy (VPAT) in healthy adults and the association between VPAT and functional near infrared spectroscopy to determine the effect of VPAT on cortical activation. Results suggest that VPAT may be feasible and could induce similar behavioral adaptation as conventional prism adaptation therapy.

Virtual Prism Adaptation Therapy: Protocollo per la convalida in adulti sani

Hemispatial neglect is a common impairment after stroke. It is associated with poor functional and social outcomes. Therefore, an adequate intervention is ...

Lower Limb Biomechanical Analysis of Healthy Participants

Biomechanical analysis techniques are useful in the study of human movement. The aim of this study was to introduce a technique for the lower limb biomechanical assessment in healthy participants using commercially available systems. Separate protocols were introduced for the gait analysis and muscle strength testing systems. To ensure maximum accuracy for gait assessment, attention should be given to the marker placements and self-paced treadmill acclimatization time. Similarly, participant positioning, a practice trial, and verbal encouragement are three critical stages in muscle strength testing. The current evidence suggests that the methodology outlined in this article may be effective for the assessment of lower limb biomechanics.

This article introduces a comprehensive experimental methodology on two of the latest technologies available to measure the lower limb biomechanics of individuals.

Analisi biomeccanica degli arti inferiori dei partecipanti sani

Biomechanical analysis techniques are useful in the study of human movement. The aim of this study was to introduce a technique for the lower limb ...

On-Site Sampling and Extraction of Brain Tumors for Metabolomics and Lipidomics Analysis

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still in need. In recent years, mass spectrometry has become a method of choice for untargeted profiling of discriminatory compound as potential biomarkers of a disease. Biofluids are generally considered as preferable matrices given their accessibility and easier sample processing while direct tissue profiling provides more selective information about a given cancer. Preparation of tissues for the analysis via traditional methods is much more complex and time-consuming, and, therefore, not suitable for fast on-site analysis. The current work presents a protocol combining sample preparation and extraction of small molecules on-site, immediately after tumor resection. The sampling device, which is of the size of an acupuncture needle, can be inserted directly into the tissue and then transported to the nearby laboratory for instrumental analysis. The results of metabolomics and lipidomics analyses demonstrate the capability of the approach for the establishment of phenotypes of tumors related to the histological origin of the tumor, malignancy, and genetic mutations, as well as for the selection of discriminating compounds or potential biomarkers. The non-destructive nature of the technique permits subsequent performance of routinely used tests e.g., histological tests, on the same samples used for SPME analysis, thus enabling attainment of more comprehensive information to support personalized diagnostics.

The manuscript presents on-site sampling of human brain tumors with solid phase microextraction followed by their biochemical profiling towards the discovery of biomarkers.

Campionamento ed estrazione in loco di tumori cerebrali per l'analisi metabolomica e lipidomica

Despite the variety of tools available for cancer diagnosis and classification, methods that enable fast and simple characterization of tumors are still ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.