Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Instituto Nacional Imperial para centro de pesquisa biomédica (BRC) saúde pesquisa (NIHR), o NIHR saúde proteção pesquisa unidade (HPRU) em infecções respiratórias no Imperial College London, em parceria com a saúde pública Inglaterra (PHE) e o centro de investigação de translação NIHR Imperial segurança do paciente. As opiniões expressadas são as dos autores e não necessariamente os do NHS, o NIHR, departamento de saúde ou saúde pública Inglaterra.

As técnicas usadas no protocolo a seguir foram aprovadas pelo Comitê de ética de pesquisa (número de referência 15/lO/0444) West London.
1. nasal absorção (NA)
<ol><li>
Preparação antes da amostragem de at
	<ol>
<li>Ao efectuar at, primeiro lave as mãos e colocar luvas, de preferência na frente do paciente.</li>
		<li>Inspecionar a cavidade nasal usando uma lanterna e tem o médico usar seu polegar não-dominante para retrair o nariz do paciente para visualizar a cavidade nasal. Nota: Um espéculo nasal não é geralmente necessário.</li>
		<li>Visualize a cavidade nasal e inferior corneto antes da amostragem. Nota: Narinas (nariz) não são redondas em secção transversal e vão direto para trás. Geralmente, corneto inferior pode ser visto como uma protuberância ou recuo na parede lateral da narina, com septo nasal formando a parede lisa, plana medial. Queremos amostra neste inferior Corneto, uma vez que o epitélio subjacente é um epitélio ciliado simples do trato respiratório44.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amostragem de at
	<ol>
<li>Quando a amostragem, passe o SAM at suavemente até o lúmen da narina, orientando-o para ser plana contra corneto inferior.</li>
		<li>Pergunte o doador para usar um dedo para pressionar o SAM para a mucosa nasal. AT pode causar uma ligeira cócegas, com possível olho molhando, como o MLF é absorvida. Nota: Em adultos, geralmente realizamos at para 60 s.</li>
		<li>Após a absorção da MLF, remova o dispositivo NA narina e colocar de volta no tubo original.</li>
		<li>Processar as amostras imediatamente em laboratório ou congelá-los, conforme detalhado no final deste protocolo. Nota: AT está sendo estudada em uma variedade de modelos de desafio da mucosa nasal e também em doenças de vias aéreas diferentes. No entanto, validação contra outros métodos de recolha de amostras respiratórias deve ser executada para cada população de estudo e paciente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. brônquica absorção (BA)
<ol><li>
Preparação antes da amostragem de BA Nota: BA é executada por pessoal especializado em uma suíte de broncoscopia.<ol>
<li>Antes de colocar o dispositivo de BA para baixo o cateter, verifique se o SAM está expulsando e retirada de volta dentro do cateter.</li>
		<li>Antes da realização BA em um paciente, realizar um BA simulado em um simulador de broncoscopia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amostragem de BA
	<ol>
<li>Passe o broncoscópio para baixo a traqueia e o brônquio principal direito para o nível do brônquio intermedius, imediatamente proximal à divisão nos lobos inferiores direito e meio. Nota: Nós normalmente amostra do brônquio intermedius, embora outros sites dentro das vias aéreas podem ser saboreados. Ao observar o cateter e o SAM, um não pode ver a ponta do broncoscópio. Observamos os seguintes passos simples para BA, uma vez que o broncoscópio alcançou o local de amostragem desejada.</li>
		<li>CATETER para baixo: Introduza o cateter de BA através do canal de funcionamento do broncoscópio até a ponta branca é apenas visível na via aérea, até um máximo de 1 cm distal à extremidade do broncoscópio. Mantenha a ponta broncoscópio e cateter no centro do lúmen das vias aéreas. Tenha cuidado para minimizar o contato entre a ponta do cateter e a mucosa dos brônquios para reduzir o risco de abrasão da mucosa.</li>
		<li>SAM OUT: Pressione o punho do dispositivo, BA para que o SAM é extrudado no lúmen das vias aéreas no lobo inferior direito ou meio. Sob visão direta, dobre a ponta do broncoscópio para garantir que o SAM está fazendo contato com o MLF na parede das vias aéreas. Deixar o SAM dentro das vias aéreas, plana para a parede da mucosa por 30 s.</li>
		<li>SAM IN: Olhe através do broncoscópio para garantir que a sonda de SAM a úmido é em linha reta e não dobrados volta sobre a extremidade do cateter. Se necessário, a ponta do cateter e broncoscópio pode ser trazida de volta para endireitar o SAM. Sob visão direta, retrai o SAM reta suavemente para o cateter. Nota: Se houver dificuldade para retrair o SAM volta dentro do cateter, retirar o dispositivo com SAM expulsado para fora das vias aéreas.</li>
		<li>CATETER acima: Retire o cateter inteiro do canal de funcionamento do broncoscópio.</li>
		<li>CORTAR o SAM: O SAM é cortado com uma tesoura esterilizada e é então colocado um criotubo no gelo. Estas amostras podem ser processadas com diferentes métodos, como detalhado mais tarde no presente protocolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. processamento de at e amostras de BA
Nota: Existem inúmeras opções para o processamento laboratorial das amostras resultantes de at e BA. Estes protocolos visam armazenar amostras para uso posterior e eluir a amostra MLF o SAM.
<ol><li>
Opções para manipulação de imediata das amostras at e BA
	<ol>
<li>Opção 1: Armazene o SAM húmido no gelo por algumas horas antes da transformação.</li>
		<li>Opção 2: Imediatamente deep freeze at SAMs na coleção do tubo. Da mesma forma, congele BA SAMs em frascos criogênicos após a remoção, com tesouras, do dispositivo de amostragem.</li>
		<li>Opção 3: Coloque o SAM destacado em tampão de eluição (300 µ l) antes da transformação direta ou profunda congelando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opções de tampão de eluição para amostras at e BA Nota: A escolha do tampão de eluição depende o que vai ser analisado na amostra MLF e sugerimos quatro alternativas principais:<ol>
<li>Use um buffer de ensaio pré-preparadas apropriado para procedimentos de imunoensaio. Tais buffers devem conter uma pequena quantidade de detergente (0.05%) bem como de proteínas, por exemplo, albumina de soro bovino (BSA) em 1%.</li>
		<li>Como alternativa, use um buffer que contém uma maior quantidade de detergente, para que a lise celular ocorre. Nota: Nós usamos buffers contendo Triton-X ou NP40 na concentração de 1%. Buffers de lise celular ativar citocinas intracelulares e extracelulares ser eluída do SAM e geralmente resultam em níveis mais elevados de citocinas e quimiocinas. Esses buffers também devem conter proteínas e são compostos com BSA 1%.</li>
		<li>Para medições de RNA, como a PCR quantitativo de RNA viral ou medição do RNA do hospedeiro, adicionar o buffer de extração de RNA diretamente para o SAM húmido. Nota: Buffers de extração de RNA caotrópicas contêm guanidínio que desnatura as proteínas. Uma alternativa é adicionar o buffer de extração de RNA ao fluido eluted MLF contido em tampão de Lise imunoensaio ou célula.</li>
		<li>Use solventes orgânicos, tais como ácido trifluoroacético, para extração de lipídios e seus metabolitos, para avaliação por espectrometria de massa. Nota: Detalhes de todos estes reagentes são incluídos na seção materiais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnica de eluição
	<ol>
<li>Para qualquer uma das técnicas de eluição acima, insira o SAM um mL 2 microcentrífuga, juntamente com o buffer de extração desejada.</li>
		<li>Vórtice misturar a amostra por 30 s para lavar o SAM de fluidos vagamente anexados e biomoléculas.</li>
		<li>Para garantir a recuperação completa de amostras, execute eluição centrífuga adicionando o SAM úmido para uma rotação filtro mini coluna que insere-se no tubo de 2 mL de microcentrífuga mesmo usado para lavar roupa. Nota: Dois tipos de rotação filtro mini coluna podem ser usados. O primeiro contém apenas um engranzamento plástico, que detém o SAM no lugar, permitindo que a eluição completa de fluidos. Alternativamente, se trabalhar com materiais infecciosos, use filtros de rotação com um tamanho de poros de 0,22 µm. Estes filtros vão esterilizar amostras e são adequados para amostras com suspeita de infecção por micobactérias. Entretanto, estes filtros devem ser pré-incubado com buffer, para minimizar a vinculação dos mediadores para o filtro por interacções não-específicas.</li>
		<li>Use Pinças esterilizadas para transferir o SAM úmido para o filtro de rotação. Alterar o fórceps entre amostras para evitar a contaminação.</li>
		<li>Amostras de centrifugar por 20 min a 16.000 x g em uma centrífuga mini resfriado a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Protocolo de exemplo do Resumo
	<ol>
<li>No laboratório, rotular 2ml microcentrífuga tubos para coleta de amostra e adicionar o volume desejado de tampão de eluição (tipicamente 300 µ l para at; 100 µ l de BA). Feche a tampa e colocar no gelo.</li>
		<li>Após a amostragem (imediatamente ou no laboratório), o SAM é retirado o identificador usando fórceps e colocados no buffer que contém o tubo de coleta (produzido na etapa anterior). Certifique-se a tampa do tubo microcentrifuga está bem fechada e transferir as amostras, no gelo, ao laboratório para processamento adicional.</li>
		<li>Remover os tubos contendo o tampão SAM e eluição de seu mix de contêiner e vórtice de transferência por 30 s.</li>
		<li>Usando a pinça estéril, remover SAM e colocar em uma coluna de rotação (com ou sem filtro de acetato de celulose 0,22 µm).</li>
		<li>Coletar o tampão de eluição do tubo da coleção e reter.</li>
		<li>Coloque a coluna de rotação, com SAM, no tubo da coleção original (ou uma nova se filtragem estéril amostras) e adicionar o buffer de coleção para girar a coluna. Desta forma, o fluido de lavagem passará através da coluna de rotação volta no tubo de coleta, ajudando a eluir a amostra do SAM.</li>
		<li>Centrifugar as amostras com tampas seladas (16.000 x g, 20 min, 4 ° C).</li>
		<li>Remover as amostras da centrífuga e coloc em uma cremalheira.</li>
		<li>Abra a tampa selada dos tubos e remover a coluna de rotação contendo o SAM. Descarte de SAM e girar a coluna em um recipiente de recolha apropriado.</li>
		<li>Cuidadosamente a alíquota o eluato contido dentro do tubo em rotulados criogênico tubos. Registre o volume total de eluato e o volume em cada alíquota.</li>
		<li>Transferir os tubos criogênicos selados para um freezer-80 ° C e armazenar na vertical até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Resultados de técnicas de amostragem de vias aéreas existentes são considerados altamente variável; técnicas de amostragem alternativos são necessários para padronizar a pesquisa dentro deste campo5. NA BA permitir a amostragem de MLF de forma não-invasiva e têm potencial emocionante para medir respostas imunes nas vias aéreas saudáveis e doentes. Estas técnicas oferecem inúmeras vantagens potenciais sobre técnicas existentes, incluindo maior tolerabilidade, velocidade de amostragem, a capacidade de repetir frequentemente a amostragem, baixa variabilidade inter-user e diminuíram a diluição dos mediadores imunes5 . A duração da absorção e da técnica de processamento usado deve ser otimizada para cada estudo e rigorosamente mantida entre eventos de amostragem. Além disso, no caso de BA, o local de amostragem dentro das vias aéreas deve ser cuidadosamente replicado entre indivíduos.
ND e particularmente BA, são ainda relativamente novas técnicas para a pesquisa clínica. No entanto, os benefícios destas técnicas resultaram em seu uso em numerosos estudos, incluindo validação cuidadosa contra técnicas alternativas5. Estes dispositivos estão agora disponíveis como dispositivos de marcação CE pronto para uso difundido na investigação respiratória. Enquanto nd e BA resultam em muito menores volumes de amostra do que as técnicas de amostragem alternativo, altas concentrações obtidas podem resultar em maior sensibilidade aos mediadores imunes baixa abundância.
Dependendo de aplicações a jusante desejadas, amostras at e BA diretamente podem ser congeladas para posterior processamento, realçando o estudo de viabilidade em um ambiente de pesquisa clínica. O protocolo para manuseio de amostras também pode ser adaptado às aplicações particulares a jusante. As técnicas de processamento sugerido podem ser usadas para a coleção de proteína ou imune mediadores lipídicos ou ácidos nucleicos, mas devem ser otimizadas para cada estudo. Em particular, MLF pode ser eluída com buffers diferentes. Em primeiro lugar, imunoensaio buffer pode ser usado para medir os anticorpos6,45, quimiocinas e citocinas na mucosa. Buffers com níveis mais elevados de detergente também podem ser usados para garantir a lise celular ocorre, permitindo a inclusão de citocinas intra celulares. Extração de RNA caotrópicas buffers de devem ser usados para a determinação da infecção viral, viral carregar, o apresentador de mRNA e o microbiome. Alternativamente, solventes orgânicos podem ser usados para lipidomics e espectrometria de massa.
Em conclusão, absorção direta de MLF de superfícies mucosas é uma técnica excitante com potencial de uso em doenças da mucosa respiratórias, gastrointestinal, urogenitais e outras. No entanto, essas técnicas de absorção promissor exigirá validação precisa de amostragem e técnica para ensaios individuais (biomarcadores) em cada configuração de doença de processamento. Além disso, estas técnicas de amostragem da mucosa precisão romance exigirá validação contra amostras convencionais, tais como de sangue, respiração e saliva. Com estas técnicas, MLF pode ser usado para medir os anticorpos, citocinas, quimiocinas, prostanoids e micróbios.

A maioria das doenças respiratórias causam uma resposta inflamatória, e há uma necessidade urgente de amostragem da superfície da mucosa respiratória na rinite alérgica, infecções virais e fúngica, tuberculose, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, pulmonar fibrose e pulmão câncer 1. Aspirado de nasofaringe (NPA), lavagem nasal e lavagem broncoalveolar (BAL) são técnicas comuns de amostragem das vias aéreas superiores e inferiores. No entanto, essas técnicas apresentam problemas consideráveis, incluindo pobre tolerabilidade, diluição de mediadores inflamatórios e a incapacidade de se repetir com frequência de amostragem2. Uma alternativa para amostragem de NPA é o uso de cotonetes, nylon reuniram-se, o algodão ou viscose3,4, mas estas também têm limitações, uma vez que causam desconforto e danos para o epitélio nasal e em alguns ligação irreversível de casos de mediadores inflamatórios5. Essas técnicas geralmente não podem ser repetidas em série, mais de uma hora, e técnicas alternativas podem ser mais eficazes para a deteção de baixa abundância citocinas e quimiocinas5,6. Além disso, a variabilidade de usuário associada com estas técnicas pode gerar inconsistências nos dados, tendo por resultado a exigência de maiores coortes de pacientes.
Alternativamente, técnicas de absorção utilizando esponjas naturais e sintéticas têm sido usadas para coletar MLF de superfícies mucosas. Esponjas de Oftalmologia é composta por celulose natural (por exemplo, Weck-cel) têm sido usados para amostra saliva, cervical e secreções vaginais7. Além disso, esponjas sintéticas, feitas de álcool polivinílico (PVA) e acetato de polivinilo hidroxilado (HPVA) foram utilizados8. Sete diferentes materiais absorventes foram comparados para amostragem de fluido oral antes da medição anticorpos9, enquanto o miniesponjas poliuretano têm sido utilizadas para coletar as lágrimas humanas10.
Papel de filtro, consistindo de celulose natural da planta do algodão tem sido amplamente utilizada para absorver as secreções nasais desde o papel pioneiro de Alam e colegas em 199211,12,13,14, 15,16,17. Papel de filtro discos produzidos a partir de cartões de filtro (por exemplo, Shandon) e têm sido utilizados para medir histaminas e citocinas depois de controlados os desafios alérgeno nasal e com exposição de alérgeno natural18,19 ,20,21. No entanto, diferentes lotes de papel de filtro variam em seu grau de ligação às proteínas e alguma falha ao liberar citocinas. Métodos utilizando uma matriz sintética de absorção (SAM), portanto, têm sido desenvolvidos2,22,23. SAMs agora são usadas geralmente para obter MLF nasal por NA. Estes materiais absorventes são confortáveis para usar e pode obter MLF nem do nariz inflamado em intervalos frequentes durante longos períodos de tempo.
Absorção nasal é uma forma de amostragem da mucosa de precisão usando uma SAM para a amostragem de MLF na via aérea superior. Dispositivos de at são fabricados como dispositivos médicos a marcação CE de materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. O sampler at consiste de um identificador e SAM em um criotubo estéril. O SAM é composto de polímeros, fibras, normalmente, mas também está disponível como espuma, e estas são selecionadas para ser macio e absorvente, com rápida absorção para coleta de amostra. SAMs tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. NA é uma técnica muito suave, não-invasivo que pode ser executada em doadores de todas as idades. Além disso, amostragem serial, mesmo em poucos minutos, é possível. AT foi validado contra as vias aéreas superiores existentes amostragem técnicas5 e amostragem repetitiva permitiu a geração de dados cinéticos seguindo o desafio da via aérea com alérgeno23,24,25, endotoxina bacteriana26 e viral-tipo TLR agonistas (JAI, a. et al., manuscrito em preparação). AT também tem sido usado em recém-nascidos para investigar a história natural da atopia27,28,29 e na bronquiolite viral30.
Bronchoscopic microsampling (BMS) é um procedimento para a coleção de MLF na via aérea inferior que foi desenvolvida por Olympus31,32,33. Infelizmente, este sistema BMS é apenas licenciado no Japão. Olympus fornecer dois sistemas BMS: um com um poliéster hidroxilado fibroso (FHPE) sonda34,35,36,37, e um com um algodão sonda n3833,, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. um obstáculo tem sido que a sonda BMS usada em pacientes com asma causados contato da mucosa, sangramento, com metade de todas as amostras contaminadas com sangue. Os autores concluíram que não era viável a amostra MLF usando este sistema BMS de vias aéreas periféricas em pacientes de asma43.
Como alternativa, temos desenvolvido BA usando uma SAM suave que pode ser executado durante a investigação bronchoscopic das vias aéreas inferiores, incluindo a infecção experimental de indivíduos asmáticos com rinovírus6a seguir. O dispositivo de BA consiste de: um cateter externo oco, uma peça de mão que na ativação extrusão o SAM e um fio-guia central de plástico que tem o SAM em sua extremidade. Quanto a AT, BA kits são fabricados com materiais de grau médico usando quartos limpos e livres de poeira e alérgenos. Além disso, dispositivos são CE marcado e são fornecidos gama irradiados. Faixa de SAM é macio, absorvente e tem rápida absorção para coleta de amostra. Também tem ligação proteína mínima para permitir que a eluição eficiente das secreções absorvidas. O dispositivo pode caber através do canal de trabalho de um broncoscópio e pode ser usado para rapidamente e com precisão da amostra MLF em locais específicos de interesse dentro das vias aéreas. Ao contrário de BAL ou BMS, BA não resulta em sangramento de contato ou após o procedimento adicional desconforto ao paciente.
Cuidadosa consideração deve ser dada para o processamento de amostras de at e BA. As amostras podem ser directamente congelado e processadas em lotes ou pode ser processada imediatamente. O tipo de processamento pode ser adaptado para determinadas aplicações a jusante, incluindo os imunoensaios de quimiocinas e citocinas, imunoglobulinas ou elutions de viral, bacteriana, e a célula hospedeira associado do RNA. Apresentamos a coleção clínica e o laboratório associadas at e BA como um guia para os investigadores clínicos de técnicas de processamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1562">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Nasosorption (adult, 7mm width)</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">NSFL-FXI-11</td>
			<td style="width:1061px;">Different sizes are available for different patient groups/ages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Bronchosorption</td>
			<td style="width:108px;">Hunt Developments</td>
			<td style="width:140px;">BSFL-FXI-11</td>
			<td>Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (without membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS9301-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">Corning&#160;Costar&#160;Spin-X&#160;centrifuge tube filters (0.22um membrane)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">CLS8160-24EA</td>
			<td>For sterilisation of samples with infection risk.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Assay (elution) buffer</td>
			<td style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:140px;">AB-33k</td>
			<td>Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:253px;">NP-40 Cell lysis buffer</td>
			<td style="width:108px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">FNN0021</td>
			<td>Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Buffer RLT (RNA extraction)</td>
			<td style="width:108px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:140px;">79216</td>
			<td>Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:140px;">302031-100ML-M</td>
			<td>For elution of samples to be used in HPLC applications</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:253px;">2.0ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:108px;">Costar</td>
			<td align="right" style="width:140px;">3213</td>
			<td>2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

absorption of nasal and bronchial fluids: precision sampling of the human respiratory mucosa and laboratory processing of samples

Os métodos de absorção nasal (NA) e absorção brônquica (BA) usam matrizes absorventes sintéticas (SAM) para absorver o líquido de mucosa (MLF) do trato respiratório humano. NA é uma técnica não-invasiva que absorve o líquido do corneto inferior e causa desconforto mínimo. AT produziu resultados reprodutíveis com a capacidade de repetir frequentemente a amostragem das vias aéreas superiores.
Por comparação, métodos alternativos de mucosa respiratória, tais como a aspiração nasofaríngea (NPA) e limpeza convencional, de amostragem são mais invasivos e podem resultar em maior variabilidade de dados. Outros métodos têm limitações, por exemplo, biópsias e procedimentos brônquicos são invasivos, escarro contém muitos mortos e morrendo células e requer a liquefação, condensado do ar exalado (EBC) contém água e saliva e lavagem as amostras são diluídas e variável.
BA pode ser realizada através do canal de trabalho de um broncoscópio na clínica. A amostragem é bem tolerada e pode ser realizada em vários locais na via aérea. BA resultados em amostras MLF, sendo menos diluído do que amostras de lavado broncoalveolar (BAL) de lavagem.
Este artigo demonstra as técnicas de at e BA, bem como o processamento laboratorial das amostras resultantes, que pode ser adaptada para o biomarcador de jusante desejada sendo medido. Estas técnicas de absorção são alternativas úteis para as técnicas de amostragem convencional usadas em pesquisa clínica respiratória.

AT tem sido utilizada em uma série de estudos para facilmente e não invasiva mede a inflamação da mucosa. Após a administração do alérgeno para o nariz, observam-se níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) para subir e descer em poucos minutos (Figura 1), em consonância com a degranulação de mastócitos (Thwaites et al., manuscrito em preparação). Além disso, os mediadores da inflamação do tipo II, tais como IL-5 (Figura 2, reproduzido com permissão de 24), podem ser medidos após alérgeno nasal desafio23,24horas. Na infecção experimental de asmáticos alérgicos e controles saudáveis, at foi usado para medir um painel de mediadores, incluindo o interferão-gama (IFN-γ), ao longo de 7 dias (Figura 3, reimpresso com permissão de 6). Além disso, na infecção natural pelo vírus sincicial respiratório (RSV) dos lactentes, at demonstrou RSV para ser associado com os níveis elevados de citocinas inflamatórias, tais como IFN-γ, em relação ao não-RSV lactentes com bronquiolite e controles saudáveis ( Figura 4, reimpresso com permissão de 30). Curiosamente, esta discriminação entre RSV e não-RSV bronquiolite não foi significativa em vez de correspondência amostras NPA (Figura 4).
BA também foi usada durante a infecção experimental de asmáticos alérgicas com rinovírus. No dia 4 de infecção por rinovírus, níveis de IFN-γ, CXCL11, IL-10 e IL-5 foram elevados da linha de base (Figura 5; A, B, C e D, respectivamente). Além disso, esta técnica demonstrou elevados níveis de IL-5 na via aérea inferior de asmáticos alérgicas durante a infecção por rinovírus, em relação a controles saudáveis (Figura 5) (Figura 5 reimpresso com permissão de 6).
Estes resultados representativos foram gerados de amostras eluídas usando buffer de ensaio contendo 0.05% Tween-20% e 1% de BSA (ver Tabela de materiais).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig1.jpg"> Figura 1 : Geração rápida e liberação de prostaglandina-D2, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Os níveis de prostaglandina-D2 (PGD2) medido a partir eluídos absorção nasal em amostras seriais seguindo o desafio de alérgeno nasal com o pólen de grama Timothy (n = 5). Cada linha representa dados de um indivíduo. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig2.jpg"> Figura 2 : Medição cinética de IL-5, seguindo o desafio de alérgeno nasal. Produção de IL-5, em amostras de absorção nasal serial seguindo o desafio de alérgeno nasal. 3 repita o alérgeno desafio estudos foram realizados, com os participantes (n = 19) receberam placebo (azul), baixa de prednisona oral dose (10 mg) (laranja), ou prednisona oral de alta dose (25 mg) (vermelha) uma hora antes da administração do alérgeno. As linhas indicam a média geométrica e barras de erro são intervalos de confiança de 95% de todos os participantes. (Figura reimpresso com permissão da Leaker et al, Imunologia da mucosa, 2017). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig3.jpg"> Figura 3 : Indução de Interferon-γ durante infecção rinovírus. Durante o desafio de infecção de adultos saudáveis (n = 11, azul) e asmáticos alérgicos (n = 28, vermelho) com 16-rinovírus, amostragem de absorção nasal foi utilizada para medir os níveis de interferon-γ (IFN-γ). Dados são representados como parcelas de espaguete A) cru dos indivíduos e níveis B) medianos com barras de erro que indicam faixas de percentis. (Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig4.jpg"> Figura 4 : Nasosorption discrimina Interferon-γ elevado associado com infecção pelo VSR dos lactentes. Absorção nasal e aspiração nasofaríngea (NPA) foram usados para medir os níveis de interferão-γ em lactentes com bronquiolite associada com infecção por vírus sincicial respiratório (VSR) (vermelho, n = 12), um patógeno respiratório não-RSV (verde, n = 12) e saudável controles (azul, n = 9). Os dados foram analisados usando um teste de Kruskall-Wallis com correção de Dunn para comparações múltiplas (* * *p< 0,001). Linhas denota valores medianos e barras de erro são faixas de percentis. (Figura modificada com a permissão de Thwaites et al 30). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56413/56413fig5.jpg"> Figura 5 : Mediadores inflamatórios em amostras de absorção brônquica durante a infecção de rinovírus. Após infecção do rinovírus-16 de controles saudáveis (n = 10, azul) e alérgicos asmáticos voluntários (n = 23, vermelho), absorção brônquica foi usada para medir os níveis de IFN-γ A), CXCL11 B), C) IL-10 e IL-5 D) na linha de base e no dia 4 de infecção. Dados analisados por Wilcoxon assinaram rank test (amostras correspondentes) e teste de Mann-Whitney (incomparáveis amostras). Figura reimpresso com permissão da Hansel et al 6 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56413/56413fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples at JoVE.com

Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Absorção de fluidos nasais e brônquicas: amostragem de precisão da Mucosa respiratória humana e laboratório de processamento de amostras

The methods of nasal absorption (NA) and bronchial absorption (BA) use synthetic absorptive matrices (SAM) to absorb the mucosal lining fluid (MLF) of the ...

absorption-nasal-bronchial-fluids-precision-sampling-human

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Medicine

Unit 1

Upper Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

29.2K visualizações.  St Mary's Hospital. Este manuscrito descreve o uso de técnicas de absorção nasal e brônquica, especificamente usando matrizes absorventes sintéticas (SAM) para o fluido de mucosa (MLF) das vias aéreas superiores e inferiores da amostra. Esses métodos fornecem melhor padronização e tolerabilidade do que as técnicas de amostragem respiratória existente.

Vídeo: Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

Processamento da mamoplastia redutora e tecidos humanos Mastectomia para cultura de células

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Medicina

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which is interesting in various respiratory diseases like asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), chronic cough, or idiopathic pulmonary fibrosis. This technique is well tolerated, safe and non-invasive, but is currently limited to research services and specialized centers in clinical practice because it is technically demanding, time-consuming, and requires trained staff. The success rate of sputum induction and analysis is about 80%.
Here, we describe the induction and laboratory processing of sputum samples. Sputum is induced by inhalation of hypertonic or isotonic saline with salbutamol. For the processing, we use the whole sputum technique. Dithiothreitol (DTT) is used to allow mucolysis of sputum samples. The primary aim of sputum processing is to obtain a differential cell count to study the cell types present in the airway lumen. Additional analyses may also be performed on sputum supernatant and sputum cells, which may allow further investigation into inflammatory processes and immune mechanisms. Examples include studying mediators in sputum supernatant and performing a large spectrum of analysis on sputum cells such as flow cytometry, genomics, or proteomics.
Finally, representative results of sputum analysis in healthy controls, asthmatics, and COPD patients are presented.

Here we describe the technique of sputum induction. This protocol also explains the sputum processing to perform a differential cell count and to collect sputum supernatant and cells for further analysis.

Metodologia para a indução de escarro e laboratório de processamento

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Sampling Strategies and Processing of Biobank Tissue Samples from Porcine Biomedical Models

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of genetically modified pig models, and the often-limited number of available animals of these models, establishment of (biobank) collections of adequately processed tissue samples suited for a broad spectrum of subsequent analyses methods, including analyses not specified at the time point of sampling, represent meaningful approaches to take full advantage of the translational value of the model. With respect to the peculiarities of porcine anatomy, comprehensive guidelines have recently been established for standardized generation of representative, high-quality samples from different porcine organs and tissues. These guidelines are essential prerequisites for the reproducibility of results and their comparability between different studies and investigators. The recording of basic data, such as organ weights and volumes, the determination of the sampling locations and of the numbers of tissue samples to be generated, as well as their orientation, size, processing and trimming directions, are relevant factors determining the generalizability and usability of the specimen for molecular, qualitative, and quantitative morphological analyses. Here, an illustrative, practical, step-by-step demonstration of the most important techniques for generation of representative, multi-purpose biobank specimen from porcine tissues is presented. The methods described here include determination of organ/tissue volumes and densities, the application of a volume-weighted systematic random sampling procedure for parenchymal organs by point-counting, determination of the extent of tissue shrinkage related to histological embedding of samples, and generation of randomly oriented samples for quantitative stereological analyses, such as isotropic uniform random (IUR) sections generated by the &#34;Orientator&#34; and &#34;Isector&#34; methods, and vertical uniform random (VUR) sections.

The practical application and performance of methods for generation of representative tissue samples of porcine animal models for a broad spectrum of downstream analyses in biobank projects are demonstrated, including volumetry, systematic random sampling, and differential processing of tissue samples for qualitative and quantitative morphologic and molecular analyses types.

Estratégias de amostragem e processamento de amostras de tecido do Biobanco de suínos modelos biomédicos

In translational medical research, porcine models have steadily become more popular. Considering the high value of individual animals, particularly of ...

Remote Laboratory Management: Respiratory Virus Diagnostics

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a multitude of issues ranging from transportation, access, facilities, equipment, and communication to provider training. To address this need, we have developed an innovative, scalable, logistics-enhanced, mobile, laboratory facility for emergencies and epidemics in resource-constrained global settings. Utilizing a background in clinical operations as an academic medical center, we designed a rapidly-deployable, modular BSL-2 and BSL-3 facility with user-friendly software for tracking and management of drugs and supplies in remote regions during epidemics and outbreaks. Here, we present our intermodal, mobile, expandable shipping-container laboratory units. The design of the laboratory facilitates off-grid usage by minimizing power consumption and allowing alternate water sources. The unit's information communication technology (ICT) platform provides (i) user-friendly tablet-based documentation, (ii) enhanced tracking of patients and supplies, and (iii) integrated communication onsite with built-in telehealth capabilities. To ensure quality in remote environments, we have developed a checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for respiratory viral diagnosis using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). As described, this innovative and comprehensive approach allows for the provision of laboratory capability in resource-limited global environments.

A rapidly-deployable, off-grid laboratory has been designed and built for remote, resource-constrained global settings. The features and critical aspects of the logistically-enhanced, expandable, multifunctional laboratory modules are explored. A checklist for a basic laboratory workflow and a protocol for a respiratory viral diagnostic test are developed and presented.

Gerenciamento remoto do laboratório: Diagnósticos de vírus respiratório

An uptick in recent pandemics (Ebola, Zika, MERS, influenza, etc.) underlines the need for a more 'nimble,' coordinated response that addresses a ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Cultura e Imagem de Organoides Epiteliais Nasais Humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Collection, Expansion, and Differentiation of Primary Human Nasal Epithelial Cell Models for Quantification of Cilia Beat Frequency

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary dyskinesia. However, the wider application of these techniques is limited by the extreme susceptibility of ciliary function to changes in environmental factors e.g., temperature, humidity, and pH. In the airway of patients with Cystic Fibrosis (CF), mucus accumulation impedes cilia beating. Cilia function has been investigated in primary airway cell models as an indicator of CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR) channel activity. However, considerable patient-to-patient variability in cilia beating frequency has been found in response to CFTR-modulating drugs, even for patients with the same CFTR mutations. Furthermore, the impact of dysfunctional CFTR-regulated chloride secretion on ciliary function is poorly understood. There is currently no comprehensive protocol demonstrating sample preparation of in vitro airway models, image acquisition, and analysis of Cilia Beat Frequency (CBF). Standardized culture conditions and image acquisition performed in an environmentally controlled condition would enable consistent, reproducible quantification of CBF between individuals and in response to CFTR-modulating drugs. This protocol describes the quantification of CBF in three different airway epithelial cell model systems: 1) native epithelial sheets, 2) air-liquid interface models imaged on permeable support inserts, and 3) extracellular matrix-embedded three-dimensional organoids. The latter two replicate in vivo lung physiology, with beating cilia and production of mucus. The ciliary function is captured using a high-speed video camera in an environment-controlled chamber. Custom-built scripts are used for the analysis of CBF. Translation of CBF measurements to the clinic is envisioned to be an important clinical tool for predicting response to CFTR-modulating drugs on a per-patient basis.

This protocol describes nasal epithelial cell collection, expansion, and differentiation to organotypic airway epithelial cell models and quantification of cilia beat frequency via live-cell imaging and custom-built scripts.

Coleta, Expansão e Diferenciação de Modelos Primários de Células Epiteliais Nasais Humanas para Quantificação da Frequência de Batimento de Cílios

Measurements of cilia function (beat frequency, pattern) have been established as diagnostic tools for respiratory diseases such as primary ciliary ...

A Traditional Chinese Medicine Characteristic Therapy for Bronchial Asthma: Moxibustion

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest tightness, or cough, as a result of increased airway reactivity. With high diurnal variation, these symptoms often occur or worsen at night or in the morning. By burning and roasting the Chinese medica above human acupoints, moxibustion is a type of treatment that stimulates the activity of the human meridians through drugs and heat stimulation to prevent and treat diseases. According to the principle of syndrome differentiation and treatment of traditional Chinese medicine, acupoints are selected on the corresponding parts, which has a definite effect. It is regarded as a characteristic traditional Chinese medicine therapy for bronchial asthma. This protocol elaborates the methods and steps of patient management, material preparation, selection of acupoints, operation, and postoperative nursing to ensure safe and effective moxibustion treatment to significantly improve the clinical symptoms and quality of life of patients with bronchial asthma.

This protocol presents a curative procedure of moxibustion in treating patients with bronchial asthma.

Uma Terapia Característica da Medicina Tradicional Chinesa para Asma Brônquica: Moxabustão

Bronchial asthma is a chronic inflammatory disease of the airway which can lead to symptoms such as recurrent wheezing, shortness of breath, chest ...

Captura de amostras de tecido de fibrose submucosa oral para análise espacial-ômica

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor em destaque: desvendando os mistérios das neoplasias potenciais orais 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...