A terapia individualizada para pacientes com fibrose cística pode ser alcançada por um modelo de doença in vitro para entender a atividade de CFTR na linha de base. Organoides epiteliais nasais humanos, ou organoides HNE, produzem lúmens de tamanhos variados que se correlacionam com a atividade cftr, distinguindo entre organoides CF e não-CF. Aqui, descrevemos em detalhes uma metodologia para acultura e imagem desses organoides do HNE.
O transporte de íons epiteliais disfuncionais, particularmente o de cloreto e bicarbonato, resulta em um volume reduzido dos fluidos de revestimento epitelial. Isso também afeta as secreções de muco que levam à mucostase e obstrução. Portanto, nosso modelo HNE foi desenvolvido para várias aplicações, dependendo do projeto experimental e recursos do pesquisador.
Além de avaliar a atividade da CFTR na linha de base ou em resposta à terapêutica, essa técnica também pode ser aplicada a outras doenças que envolvam função celular epitelial, especialmente o transporte de fluidos celulares epiteliais. Esses métodos foram desenvolvidos principalmente para uso em estudos de fibrose cística. Outros estudos que avaliam a epitélio das vias aéreas, como a diskinesia ciliar primária, também podem achar esses métodos úteis.
Essas técnicas requerem atenção aos detalhes e precisão. Eles também requerem uma observação cuidadosa para garantir que a expansão inicial das células seja apropriada. Monitore todas as culturas todos os dias, e o sucesso será mais provável.
Para começar, dissociar a biópsia da escova nasal em 8 militers de mídia RPMI em um tubo cônico de 15 mililitros passando a escova de citologia várias vezes através de uma ponta de pipeta de um mililitro grande. Centrifugar as células a 500 vezes g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e suspenda novamente a pelota celular em três mililitros da solução de descolamento celular.
Incubar em temperatura ambiente por 16 minutos para digerir. Use cinco mililitros da mídia de expansão para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione-os a um frasco T75, pré-semeado com fibroblastos irradiados, inativados e 50 a 60% confluentes 3T3.
Permitir que as células co-cultura e expandir na mídia de expansão por 7 a 14 dias. Se antibióticos foram introduzidos para células derivadas de pacientes com fibrose cística, a mídia deve ser substituída por mídia de expansão livre de antibióticos após os três dias iniciais de cultura, e pode continuar mudando a mídia a cada dois dias até 80% confluente. Lave as células com 1x DPBS.
Em seguida, adicione 1,5 mililitros de 0,05% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar por quatro minutos a 37 graus Celsius para remover o fibroblasto 3T3 irradiado e inativado da cultura. Enxágüe o frasco T75 com 1x DPBS duas vezes para lavar completamente todos os fibroblastos 3T3 restantes. Adicione 1,5 mililitros de 0,05% trypsin-EDTA no frasco T75 e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius para desacopar HNEs.
Neutralizar a trippsina com inibidor de trippsina de soja em uma proporção de um para um. Centrifugar as células a 500 vezes gi por cinco minutos. Em seguida, descarte o supernatante e lave as células com cinco mililitros de mídia de expansão uma vez.
As células estão prontas para semeadura para cultivar organoides. Descongele a cultura organoide matriz extracelular ou ECM durante a noite a quatro graus Celsius. Esfrie os slides de angiogênese de 15 poços durante a noite na mesma temperatura.
Em seguida, esfrie as pontas da pipeta a quatro graus Celsius. Cubra os slides com cinco microliters de frio 100% ECM no gelo. Coloque-os em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos para consolidação.
Conte os HNEs colhidos da cocultura usando um hemótmetro. Em seguida, diluir as células para 500 células por microlitres no número total, com 20% de ECM diluído por meios de diferenciação no gelo. Leve os slides revestidos de ECM para fora da incubadora e sementes cinco microliters da mistura ECM de célula fria em cada um dos poços.
Transfira os slides imediatamente para uma incubadora de cultura a 37 graus Celsius por uma hora para consolidar a mistura de ECM celular. Depois disso, tire os slides da incubadora e alimente as células em cada poço dos slides de angiogênese de 15 poços com 50 microliters da mídia de diferenciação. Devolva o slide para a incubadora de cultura a 37 graus Celsius, mudando a mídia a cada dois dias até que os organoides estejam prontos para novas experiências.
Pré-trate os slides de câmara de 8 poços com adesivo de célula por 30 minutos. Descarte a solução e seque os poços por mais 30 minutos. Em seguida, descarte a mídia do topo do ECM e, em seguida, adicione 50 microliters do PBS 1x frio em cada poço dos slides de 15 poços no gelo.
Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes usando 200 microliters da ponta de pipeta de grande furo. Distribua a solução no centro de um poço dos slides de câmara de 8 poços. Remova o excesso de líquido imediatamente dos poços por uma pipeta de ponta fina.
Em seguida, coloque a câmara deslizando em uma incubadora Celsius de 37 graus por 40 minutos para melhorar o organoide aderindo ao fundo do vidro. Após 40 minutos, lave suavemente os organoides com 1x PBS duas vezes e fixe-os com 300 microlitres de 4% de paraformaldeído em cada poço por 30 minutos definir a temperatura ambiente. Lave duas vezes com 1x PBS e armazene os organoides em 1x PBS definir quatro graus Celsius para imunostaining por até duas semanas.
Para colher os organoides para estudos histológicos, remova a mídia da cultura e adicione 50 microliters de frio de um 1x PBS em cada poço dos slides no gelo. Pipeta para cima e para baixo três a cinco vezes usando uma ponta de pipeta de 200 microliter de furo grande. Combine todas as soluções do slide de 15 poços ou inserções de cultura em um tubo cônico de 15 mililitros no gelo.
Ajuste o volume total da solução no tubo para 10 mililitros adicionando PBS frio de 1x. Centrifugar o tubo a quatro graus Celsius, 300 vezes g por cinco minutos. Em seguida, aspire o supernascer e adicione 60 microliters de histogel quente para misturar com a pelota organoide usando uma ponta de pipeta de 200 microliteres de grande furo.
Transfira a suspensão imediatamente para um molde de histologia. Depois de consolidar o histogel à temperatura ambiente, coloque o bloco de molde em 4% de paraformaldeído para fixação durante a noite a quatro graus Celsius. Abra o software e clique com o botão direito do mouse na parte inferior da tela.
Em seguida, selecione Controles de Análise, seguido por Resultados de Medição Automatizados. Abra a imagem organoide e selecione 5 a 10 organoides com lúmens visíveis. Mantenha o clique direito na imagem para abrir o menu e selecione ROI Poligonal para delinear o organoide completo para obter a área total da superfície do organoide.
Em seguida, delineie o lúmen para obter a área do lúmen. Repita isso para os organoides restantes no poço, e todos os poços do ensaio. Por fim, exporte os dados para o Excel.
Divida a área de lúmen pela área total da superfície e, em média, todos os organoides da amostra para obter a Razão de Lumen de Linha de Base. As imagens de campo brilhante representam HNEs de uma coleção de amostras bem sucedidas e mal sucedidas. Os HNEs crescem bem em um grande aglomerado.
Em contraste, os HNEs crescem mal em dois pequenos aglomerados ao redor das células 3T3 irradiadas. Organoides no slide de 15 poços têm imagens mais precisas e nítidas do que as da inserção cultural. Além disso, não foi observada diferença morfológica significativa nesses dois métodos culturais.
Organoides não CF normalmente têm um lúmen maior e mais fluido do que os organoides CF. As manchas de HNE em organoides de um sujeito não CF, F508del/F508del, e a coloração imunofluorescente de cílios em um organoide são mostradas nestas imagens. Os cílios manchados com acetilada-tubulina, anticorpo secundário fitc rotulado e os núcleos rotulados com DAPI são mostrados aqui.
Imagens máximas de projeção dos dois organoides representativos por coloração imunofluorescente de montagem total e suas imagens de reconstrução tridimensionais correspondentes são mostradas aqui. Muco e cílios dentro do lúmen dos organoides são mostrados. As imagens gráficas representam o ensaio de inchaço induzido por forskolina para testar a função CFTR nas células epiteliais primárias.
Um experimento representativo de dose-resposta de forskolin de voluntários não CF é mostrado aqui. A dose-resposta fsk é comparada com a variação fracionária média em uma hora, em comparação com oito horas, o que sugere que o ensaio de oito horas pode produzir uma diferença de inchaço mais significativa entre diferentes doses de FSK do que aquelas em uma hora. A área sob a curva pode apresentar uma pequena diferença no inchaço em comparação com a variação fracionária média em oito horas.
Ao tentar este procedimento, tenha em mente que os organoides serão perdidos durante o processo de coleta, fixação e coloração. Assim, deve-se tomar cuidado meticuloso durante cada etapa e números iniciais suficientes devem ser obtidos para garantir o sucesso. O crescimento de organoides nas pastilhas culturais pode ajudar nesse sentido, pois essas técnicas são desenvolvidas.
Aqui, usamos reagentes e suprimentos disponíveis comercialmente para facilitar a expansão para outros investigadores. Também foi desenvolvido um ensaio funcional que utilizava técnicas comuns de microscópio e equipamentos mais especializados.
