Esta técnica permite a amostragem de milt de um pequeno modelo de peixe, o japonês Madaka, e a investigação de sua qualidade de maneira consistente. Especificamente, a coleta de espermatozoides por massagem abdominal permite a amostragem repetida no mesmo peixe, pois essa abordagem não é invasiva. Além disso, esta técnica pode ser aplicada para a preservação do crio de esperma de Madaka.
A qualidade dos espermatozoides é um indicador essencial do sucesso da fertilização e, portanto, um parâmetro importante a ser analisado em estudos ecológicos e de fisiologia produtiva completa. Para começar, prepare uma esponja macia, cortando-a para caber presunçosamente em uma placa de Petri. Corte uma linha reta no meio da esponja, que seja longa o suficiente para segurar o peixe em seu lado ventral para cima.
Depois de anestesiar o peixe, seque o abdômen do peixe limpando-o suavemente com uma toalha de papel. Coloque o peixe na calha da esponja de retenção úmida com o lado ventral para cima, de modo que suas brânquias sejam expostas à solução anestésica na esponja. Se a área ao redor da cloaca estiver molhada, seque suavemente a parte inferior do abdômen com um lenço de papel descartável.
Sob um microscópio de dissecação, coloque a micropipeta com um tubo aspirador ligado contra a cloaca do peixe. Agora massageie o abdômen do peixe apertando suavemente com uma pinça lisa de extremidade romba em um movimento rostral a caudal. Para a recuperação do peixe, solte-o da esponja na água de recuperação previamente preparada antes de devolver o peixe ao sistema de aquário.
Transfira o milt coletado para um tubo contendo solução ativadora pré-aquecida e solução de pipeta para cima e para baixo várias vezes usando o conjunto do tubo aspirador. Homogeneizar o esperma diluído suavemente agitando os tubos antes da análise. Após a eutanásia do peixe, seque-o como demonstrado anteriormente e coloque-o sob um microscópio de dissecação com o lado lateral esquerdo voltado para cima.
Usando pequenas tesouras dissecantes, corte um retalho dorsalmente da cloaca e, em seguida, através das costelas até as brânquias para expor os órgãos internos. Localize os testículos e corte o acessório em ambas as extremidades com pinças finas. Remova os testículos e transfira-os para um tubo preparado contendo solução ativadora pré-aquecida.
Use a pinça para esmagar os testículos várias vezes contra o lado do tubo para liberar o esperma, que pode ser visualizado pela aparência ligeiramente turva da solução. Para iniciar a análise, abra o software de análise de espermatozoides e selecione o módulo de motilidade. Defina as configurações no software para todos os parâmetros.
Coloque uma lâmina de câmara de contagem descartável pré-aquecida de 20 micrômetros sob o microscópio em um palco aquecido, ajustado a 27 graus Celsius. Pipetar a amostra para a câmara na lâmina até que ela se encha, mas sem encher demais. Limpe cuidadosamente o excesso de amostras da entrada da câmara para evitar o movimento de deriva das células na solução.
Selecione analisar para olhar para a amostra sob o microscópio. Certifique-se de que o microscópio esteja focado e selecione analisar novamente para registrar o esperma no campo. Mova o slide para uma nova área da amostra no quadro e repita o procedimento por três a cinco campos de visão diferentes, evitando bolhas de ar, massas celulares ou artefatos.
Para visualizar os resultados, selecione os resultados e clique duas vezes em um campo para visualizar o campo individual ou para verificar manualmente se há espermatozoides rotulados ou não rastreados incorretamente. Se necessário, clique com o botão direito do mouse em espermatozoides individuais para renomear a motilidade. No presente estudo, a análise espermática assistida por computador foi utilizada para registrar vários parâmetros de velocidade e movimento.
Os valores calculados incluem o índice de retidão, o índice de linearidade e a oscilação. A osmolaridade das soluções de ativação impactou a motilidade dos espermatozoides a partir da dissecção dos testes. Os espermatozoides eram imóveis na água do aquário, mas móveis na HBSS com alta e baixa osmolaridade.
No entanto, a motilidade é significativamente reduzida em 36 mili osmol por quilograma, em comparação com soluções de osmolalidade mais altas. A motilidade também foi afetada pelo método de coleta de espermatozoides, em que os espermatozoides são significativamente mais móveis no método de dissecção do testículo em comparação com a massagem abdominal. Além disso, uma porcentagem maior das células era progressiva e mais células eram médias ou de movimento rápido.
A porcentagem de motilidade e progressividade é significativamente maior no esperma armazenado a quatro graus Celsius ou no gelo, em comparação com o armazenamento de 27 graus Celsius. As condições ambientais e de alojamento também afetaram ligeiramente a motilidade espermática. Nenhuma diferença significativa na motilidade espermática foi observada nos espermatozoides coletados após e antes da desova.
Machos alojados sem fêmeas por um mês apresentaram alta motilidade, mas a diferença foi insignificante. Para a coleta de espermatozoides por massagem abdominal, o treinamento é necessário para aprender a pressão e o movimento adequados da pinça e evitar a contaminação por fezes. Esta técnica será muito útil para investigar, por exemplo, os efeitos de diversos poluentes na fertilidade masculina em estudos ecotoxicológicos, onde Medaka é um modelo comumente usado.
