Este estudo foi suportado pelo nacionais de investigação, desenvolvimento e inovação escritório da Hungria (grant 116912 ÁH), o escritório de custo (alimentação e agricultura custo ação FA1205: AQUAGAMETE), o programa de bolsas do Hungaricum (grant para ZM) e o novo Húngara nacional excelência Predoctoral Fellowship (grant Para EK).

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela lei húngara de bem-estar Animal.
1. preparação do reagente
<ol><li>Soluções conservadas em estoque<ol>
<li>Prepare 1 M trealose adicionando 0,378 g de trealose di-hidratado em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare-se 1 M de sacarose adicionando 0,342 g de sacarose em 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare 1 M HEPES adicionando 0,238 g de HEPES a 1 mL de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente.</li>
		<li>Prepare a colagenase 20 mg/mL (290 U/mg) pela adição de 100 mg para 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Preparar a tripsina de 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) adicionando-se 75 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 1 mg/mL DNase eu (~ 3000 U/mg) pela adição de 5 mg a 5 mL de PBS. Misture bem até que se dissolva. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota de 50 μL em 0,2 mL PCR tubos e congelar a - 20 ° C.</li>
		<li>Prepare-se 0,4% trypan azul adicionando-se 40 mg de azul de Tripan a 10 mL de PBS. Filtro estéril através de 0,2 µm de filtros. Alíquota 1 mL em tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Preparar a 200 mg/L de MS-222 (sulfonato de metano tricaina) adicionando-se 200 mg de MS-222 em 1 L de dH2Mix O. bem até que se dissolva completamente. Além disso, o MS-222 tampão com bicarbonato de sódio para um pH neutro de 7.0.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para vitrificação<ol>
<li>Preparar a solução de equilíbrio (ES): preparar 2 mL de ES misturando 121.5 µ l de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 µ l de propilenoglicol (PG; 1,5 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l da solução estoque de trealose (0,1 M), 50 µ l de solução-mãe de HEPES (25 mM) e 1208.5 µ l de L-15 em um 2 tubo mL.</li>
		<li>Preparar a solução de vitrificação (VS): preparar 2 mL de VS misturando 439 µ l de PG (3 M), 426 µ l de dimetil sulfóxido (Me2então; 3 M), 200 µ l de FBS (10%), 200 µ l de solução-mãe de trealose (0,1 M), 50 µ l de HEPES estoque solução (25 mM) e 685 µ l de L-15 em um tubo de 2 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluções para o aquecimento<ol>
<li>Preparar a solução de aquecimento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 450 µ l de solução de sacarose (3M) e 900 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL misturando 150 µ l de FBS (10%), 150 µ l de solução de sacarose (1 M) e 1200 µ l de L-15.</li>
		<li>Preparar a solução de aquecimento 3 (WS3): preparar 1,5 mL de WS2 em um tubo de 2 mL por mistura de 150 µ l FBS (10%) e 1350 µ l de L-15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de digestão: para cada amostra prepare 500 µ l da solução de digestão, misturando-se 50 µ l de solução colagenase (2 mg/mL), 50 µ l de solução tripsina (1,5 mg/mL), 10 µ l de DNase I (20 µ g/mL) e 390 µ l de L-15 em um 2 mL do tubo.</li>
	<li>Obter ferramentas de dissecação: tesoura, micro-tesouras, pinças, pinças curvas e agulhas de acupuntura.</li>
</ol>2. testículos coleção
<ol><li>Eutanásia o peixe, colocando-o em um prato contendo 200 mg/L de MS-222 (pH = 7). Antes de continuar com a dissecação, certifique-se que as brânquias têm parou de se mexer e pelo menos 10 min se passaram desde aquele momento para garantir a morte por hipóxia.</li>
	<li>Seque o peixe, acariciando-o em uma toalha de papel e coloque-o de lado dorsal em uma esteira de dissecação.<ol>
<li>Em primeiro lugar, corte as barbatanas peitorais e pélvicas para dissecação mais fácil.</li>
		<li>Horizontalmente, cortar a pele na barriga do peixe entre as barbatanas peitorais e cortar a pele e o músculo subjacente ao longo da barriga até a nadadeira anal.</li>
		<li>Abra a cavidade do corpo do peixe e fixar a parede corporal esquerda e direita para o tapete de dissecação com agulhas. Nota: Os testículos estão localizados acima os órgãos gastrointestinais em ambos os lados da natação bexiga (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para evitar contaminação, não retire os órgãos gastrointestinais, mas suavemente empurrá-los para um lado e retire o testículo do lado oposto. Os testículos estão ligados à parede do corpo então remova-os cuidadosamente e cortar o ligação peritônio por micro-tesouras.</li>
	<li>Além disso, a fim de evitar a contaminação, em primeiro lugar esterilizar os testículos colocando-os em etanol a 70% por 2 s e depois coloque-os em L-15 em uma placa de 96 poços no gelo. Nota: Se for necessário, testículos limpos de tecido adiposo e grandes vasos sanguíneos precisamente sob o microscópio estereoscópico</li>
</ol>3. ultrarápido arrefecimento do tecido Testicular
<ol><li>Agulhas de Mark com Etiquetas apropriadas, dependendo do exemplo digite e preparem a equilibração (ES) e soluções de vitrificação (VS).</li>
	<li>Transferi os testículos para uma placa bem maior ou prato e pino dois ou três testículos (ou mais dependendo do tamanho da agulha) em uma agulha estéril de acupuntura.<ol>
<li>Em primeiro lugar, posição do testículo no topo curvas pinças. Coloque a ponta da agulha no meio do testículo e puxe cuidadosamente o testículo para cima, com a pinça.</li>
		<li>Após a punção do testículo, gentilmente puxe-o para cima em direção ao topo da agulha. Certifica-se de que os testículos são separados uns dos outros e que não estão caindo ou deslizar para baixo.</li>
		<li>Lugar cheio de agulhas com testículos fixados em um tubo de 2 mL com L-15 até vitrificação (em 25 ˚ c; tempo de armazenamento não deve exceder 1 h). Nota: Condecorando os testículos a agulha deve ser feito rapidamente para evitar que os testículos de secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir a agulha com testículos para a solução de equilíbrio e incubar durante 5 min à 25˚C.</li>
	<li>Transferir a agulha para a solução de vitrificação e incube por 30 s em 25˚C.</li>
	<li>Retire a agulha a partir da solução de vitrificação, rapidamente e suavemente absorver o restante da solução do tecido por uma toalha de papel estéril. Tome cuidado para evitar os testículos degola para a toalha de papel ou cair.</li>
	<li>Rapidamente Coloque a agulha no nitrogênio líquido, colocado em uma caixa de isopor. Nota: Fazer este passo rapidamente para evitar a exposição do tecido para o vapor de nitrogênio líquido. Use volumes baixos de nitrogênio líquido para evitar a contaminação das amostras.</li>
	<li>Manter a agulha em nitrogênio líquido em uma caixa de isopor fechada por 5-10 min.</li>
	<li>Precool um criotubo abriu 4,5 mL e sua tampa na mesma caixa.</li>
	<li>Após 5-10 min, transfira cada agulha em um separado criotubo sob a superfície do nitrogênio líquido e fechar o criotubo. Atenção: Sempre use roupas de proteção (como luvas isoladas) quando trabalhar com nitrogênio líquido como exposição pode levar a graves queimaduras.</li>
	<li>Coloque o criotubo com um bastão de metal e colocá-lo no recipiente do cryobank mais rápido possível. Armazenar as amostras em um armazenamento de cilindro dewar até utilização posterior.</li>
</ol>4. procedimento de aquecimento
<ol><li>Cada agulha quente separadamente. Todas as soluções de aquecimento devem ser a 25 ° C.</li>
	<li>Desanexe o criotubo da cana-de-metal e mergulhá-lo no nitrogênio líquido armazenado em uma caixa de isopor.</li>
	<li>Abra o criotubo no vapor de nitrogênio líquido (usando fórceps) e liberar a agulha para o nitrogênio líquido.</li>
	<li>Transferir a agulha muito rápido para a primeira solução de aquecimento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Certifique-se de transferir a agulha rapidamente para evitar o seu aquecimento no ar durante a transferência.</li>
	<li>Transferir a agulha para a segunda solução de aquecimento e incube por 3 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Transferir a agulha para a terceira solução de aquecimento e incubar durante 5 min (a 25 ° C).</li>
	<li>Libere os testículos da agulha deslizando-as para baixo com uma pinça curvada. Lugar cada testículo aquecido individualmente em um poço separado (placa de 96 poços) repleto de 250 µ l de L-15 suplementado com 10% FBS. Certifique-se que os poços são rotulados de acordo com a amostra. Manter a placa bem no gelo até que todas as amostras são aquecidas e até trabalhos futuros.</li>
</ol>5. tecido digestão
<ol><li>Prepare-se para cada amostra em tubos separados 2 mL 500 µ l da solução de dissociação. Etiquete os tubos de acordo com o código da amostra. Incube a solução preparada de dissociação por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione o tecido aquecido para a solução de digestão e corte em pedaços pequenos pelo menos 30 movimentos de tesoura pequena.</li>
	<li>Incube o tecido cortado em uma placa de agitação durante 90 minutos a 25 ˚ c.</li>
	<li>Parar o processo de digestão, adicionando a 400 µ l de L-15 e 100 µ l de FBS (FBS 10% v/v). Brevemente, agitar a solução e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Filtre a solução obtida através de 50 µm de filtros em um tubo de 1,5 mL. Rotule os tubos em conformidade.</li>
	<li>Centrifugue a solução filtrada em 200 × g por 10 min a 25 ˚ c.</li>
	<li>Retire o sobrenadante cuidadosamente e resuspenda o pellet em 20 µ l de L15 suplementado com 10% FBS. Manualmente, agite o tubo até a pelota é completamente dissolvida. Manter a suspensão de células no gelo ou no 4 ˚ c até nova utilização.</li>
</ol>6. viabilidade avaliação e contagem de células
<ol><li>Mistura de 5 µ l de suspensão de células e 5 µ l de solução de azul de Tripan 0,4% em um tubo PCR apropriadamente rotulado 0,2 mL. Se forem usados diferentes volumes, certifique-se de que a razão de diluição de 1:1 permanece.</li>
	<li>Incube a esta suspensão para 1 a 3 min à temperatura ambiente (25 ° C).</li>
	<li>Verifica a viabilidade de cada amostra em um hemocytometer sob o microscópio.</li>
	<li>Conte o número de células vivas (inocente por trypan blue) em 15 campos. Calcule o número total de células em 20 µm da suspensão celular. A suspensão está agora pronta para qualquer aplicação a jusante. Nota: Ao otimizar o procedimento para as outras espécies com maior tamanho corporal, use fragmentos de testículo de peso igual. Use os testículos de um indivíduo para todos os grupos experimentais a fim de evitar a variabilidade individual nos resultados. No caso de zebrafish, tiramos proveito do fato de que esquerda e direito testículo deve conter um número igual (ou muito semelhante) de células germinativas13 (Ver os resultados do representante). O testículo esquerdo foi mantido como um controle enquanto o testículo direito foi vitrificados/aquecido. Porcentagem de viabilidade foi calculada o número de células isoladas de testículo vitrificados/aquecido em relação ao número de células isoladas de testículos frescos.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+the+germplasm+of+animals+used+in+biological+and+medical+research:+Importance,+impact,+status,+and+future+directions.">Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions.</a> Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).</li><li>Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+and+In+Vitro+Fertilization+at+the+Zebrafish+International+Resource+Center.">Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center.</a> Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).</li><li>Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+simplified+and+standardized+protocol+with+potential+for+high-throughput+for+sperm+cryopreservation+in+zebrafish+Danio+rerio.">Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio.</a> Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).</li><li>Morris, J. P., Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+sperm+cryopreservation+with+N,N-dimethylacetamide.">Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide.</a> Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).</li><li>Yoshizaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogonial+transplantation+in+fish:+A+novel+method+for+the+preservation+of+genetic+resources.">Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources.</a> Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).</li><li>Gao, D., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cryoinjury+in+living+cells.">Mechanisms of cryoinjury in living cells.</a> ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).</li><li>Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horv&#225;th, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+challenges+and+perspectives+on+fish+gamete+cryopreservation:+A+mini-review.">Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).</li><li>K&#225;sa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+sperm+vitrification+protocols+for+freshwater+fish+(Eurasian+perch,+Perca+fluviatilis)+and+marine+fish+(European+eel,+Anguilla+anguilla).">Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla).</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).</li><li>Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+channel+catfish+with+sperm+cryopreserved+by+rapid+non-equilibrium+cooling.">Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling.</a> Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).</li><li>Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle+immersed+vitrification:+A+practical+and+convenient+method+with+potential+advantages+in+mouse+and+human+ovarian+tissue+cryopreservation.">Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation.</a> Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Live+Offspring+from+Testicular+Tissue+Cryopreserved+by+Vitrification+Procedures+in+Japanese+Quail+(Coturnix+japonica).">Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Biol. Reprod. 88 (5), 124 (2013).</li><li>Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+needle-in-straw+vitrification+can+effectively+preserve+the+follicle+morphology,+viability,+and+vascularization+of+ovarian+tissue+in+Japanese+quail+(Coturnix+japonica).">Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica).</a> Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).</li><li>Lee, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+cryopreservation+of+spermatogonia+in+critically+endangered+Manchurian+trout+(Brachymystax+lenok).">Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok).</a> Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).</li><li>Marques, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+of+zebrafish+(Danio+rerio)+ovarian+follicles+after+vitrification+in+a+metal+container.">Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container.</a> Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).</li><li>Luji&#263;, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+successful+vitrification+of+salmonid+ovarian+tissue.">First successful vitrification of salmonid ovarian tissue.</a> Cryobiology. 76, 154-157 (2017).</li><li>Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., Garc&#237;a-Xim&#233;nez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+cell+viability+of+three+zebrafish+testicular+cell+or+tissue+cryopreservation+methods.">Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods.</a> CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).</li><li>Marinovi&#263;, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryosurvival+of+isolated+testicular+cells+and+testicular+tissue+of+tench+Tinca+tinca+and+goldfish+Carassius+auratus+following+slow-rate+freezing.">Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).</li><li>P&#353;eni&#269;ka, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+early+stage+Siberian+sturgeon+Acipenser+baerii+germ+cells,+comparison+of+whole+tissue+and+dissociated+cells.">Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells.</a> Cryobiology. 72, 119-122 (2016).</li><li>Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+eggs+and+sperm+from+cryopreserved+whole+testes.">Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso ultra rápido refrigeração procedimento desenvolvido para espécies de mamíferos e aviária10,11,12 para a criopreservação do testículo de peixe (zebrafish como modelo organismo). A maioria dos estudos anteriores sobre criopreservação dos recursos genéticos de zebrafish concentraram-se principalmente na criopreservação de esperma de zebrafish<sup class="...

Novas tendências na ciência e biotecnologia levaram à criação de milhares de novas linhas de mutantes de camundongos, drosófila, zebrafish e outras espécies utilizadas como organismos modelo em biomédicas e outras ciências1. Além disso, como novas tecnologias são desenvolvidas e se tornam disponíveis, os números das linhas mutantes constantemente aumentam2. Isto leva à necessidade para um armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. Como um método que permite a armazenagem segura dos recursos genéticos por um período indefinido de tempo, criopreservação oferece muitas vantagens, tais como extensão da temporada reprodutiva, contorna a necessidade de manutenção contínua dos reprodutores, e é mais custo - e eficiência do trabalho2.
Protocolos de criopreservação de espermatozoides desenvolvidos durante os últimos vários anos2,3,4 oferecem a oportunidade para armazenamento bem sucedida do zebrafish material genético masculino. No entanto, criopreservação de ovos ou embriões de peixe ainda não é possível devido à sua estrutura complexa e grandes quantidades de material de gema. Recentemente, a prática do transplante de células germinativas primordiais (PGCs) ou células-tronco das espermatogónias (SSCs) oferece um desvio para essa barreira, desenvolvendo-se em ovos e esperma funcional após transplante5. Portanto, a criopreservação de SSCs oferece uma nova fronteira na conservação dos recursos genéticos raros e valiosos.
Apesar de criopreservação oferece muitas vantagens, o processo de congelação lenta-taxa gera várias condições que podem levar a célula danos2. Estes incluem a formação de gelo intracelular e extracelular, desidratação, toxicidade crioprotetoras e outros. Gelo intracelular danifica as células, gelo extracelular pode levar ao esmagamento mecânico das células, enquanto a difusão de água das células durante a lenta taxa de congelamento pode levar a desidratação6. Recentemente, foi aplicada na criopreservação de gâmetas de peixe a7,8,9vitrificação como uma técnica que previne os efeitos negativos da formação de gelo. Apresenta uma técnica de resfriamento ultra rápida através do qual os meios de comunicação internos e externos se transformar em um estado amorfo/vítreo sem reveladores em gelo7,10. Bem sucedida vitrificação de tecido ovariano e testicular tem sido evidenciada na espécie aviária e mamíferos10,11,12, abrindo assim as possibilidades de sua aplicação em peixes, também.
Neste estudo, apresentamos o processo de vitrificação (NVI) agulha imergido para a criopreservação de testículos de zebrafish toda. Vamos demonstrar um método confiável para o isolamento do zebrafish estágio inicial de pilhas de germe sem contaminação e um processo de criopreservação que produz relativamente grandes quantidades de células germinativas de fase inicial com uma baixa presença de outras células, especialmente de espermatozoides. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a demonstrar um protocolo detalhado visualizado para refrigeração ultra rápida de tecido gonadal de peixe e as células da linha germinal do zebrafish. Além disso, a repetibilidade do método é demonstrada no cinco estirpes diferentes zebrafish: AB tipo selvagem, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leo,t1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] e linha de transgénicos Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="948">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">Leibovitz media (L-15)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">L1518</td>
			<td style="width:296px;">Supplemented with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">F9665</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:232px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:232px;">HEPES</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">H3375</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:232px;">Sucrose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trehalose</td>
			<td style="width:220px;">Acros Organics</td>
			<td>99-20-7</td>
			<td style="width:296px;">Dihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Methanol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">20740-0-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Propylene glycol</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">08860-1-08-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:220px;">Reanal</td>
			<td style="width:200px;">00190-1-01-65</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Collagenase</td>
			<td style="width:220px;">Gibco</td>
			<td style="width:200px;">9001-12-1</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypsin</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T8003</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:232px;">DNase I</td>
			<td style="width:220px;">Panreac AppliChem</td>
			<td style="width:200px;">A3778</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:200px;">T6146</td>
			<td style="width:296px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:232px;">Phospate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:220px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td>Tablets for preparation of 200 ml PBS solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryopreservation of zebrafish spermatogonia by whole testes needle immersed ultra-rapid cooling

As tendências atuais na ciência e biotecnologia levam à criação de milhares de novas linhas em organismos-modelo, assim, levando à necessidade de novos métodos para o armazenamento seguro dos recursos genéticos, além de práticas comuns de manter colônias de reprodução. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Criopreservação de células germinativas de fase inicial pelos testículos todo NIV oferece possibilidades para o armazenamento de zebrafish recursos genéticos, especialmente desde que após transplante eles podem amadurecer em gâmetas masculinas e femininas. Os testículos foram extirpados, preso em uma agulha de acupuntura, incubada em dois meios de cryoprotective (solução de equilibração contendo metanol de 1,5 M e 1,5 M propilenoglicol; e solução de vitrificação contendo o sulfoxide dimethyl 3M e 3M propileno glicol) e caiu em nitrogênio líquido. Amostras foram aquecidas em uma série de três soluções de aquecimento consequentes. As principais vantagens desta técnica são (1) a falta de espermatozoides após a digestão dos testículos aquecidos, facilitando assim a jusante manipulações; (2) ultra rápido resfriamento permitindo a exposição ideal dos tecidos ao nitrogênio líquido, portanto, maximizando o resfriamento e reduzindo a concentração necessária de crioprotectores, reduzindo assim a sua toxicidade; (3) síncrona exposição dos testículos vários crioprotectores e nitrogênio líquido; e (4) repetibilidade demonstrado pela obtenção de viabilidade de acima de 50% em cinco estirpes diferentes do zebrafish.

Em média, o número de células germinativas de fase inicial isolado de um testículo único zebrafish fresca variou entre 40.000 e 200.000 células dependendo do tamanho do peixe. Quando digerindo testículos zebrafish fresco em todas as 5 estirpes, células germinativas-início não eram as única células presentes nas suspensões celulares (Figura 2). Ao lado as células germinativas de estágio inicial, numerosos espermatozoides foram encontrados també...

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Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Criopreservação de Zebrafish espermatogónias por toda agulha testículos imersos refrigeração ultra rápida

O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

cryopreservation-zebrafish-spermatogonia-whole-testes-needle-immersed

Research

JoVE Journal

Biology

8.2K visualizações.  Szent István University. O principal objetivo deste estudo foi adaptar-se a agulha imerso procedimento de vitrificação (NVI) para cryopreserve toda zebrafish testículos. Além disso, a repetibilidade do método em cinco estirpes diferentes zebrafish foi testada.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Transplante de Medula Renal inteiro em Zebrafish Adulto

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biologia

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an organism that contains cells from more than one animal; mosaics are one type of chimera in which cells from more than one genotype are mixed, usually wild-type and mutant. In the zebrafish, chimeras can be readily made by transplantation of cells from a donor embryo into a host embryo at the appropriate embryonic stage. Labeled donor cells are generated by injection of a lineage marker, such as a fluorescent dye, into the one-cell stage embryo. Labeled donor cells are removed from donor embryos and introduced into unlabeled host embryos using an oil-controlled glass pipette mounted on either a compound or dissecting microscope. Donor cells can in some cases be targeted to a specific region or tissue of the developing blastula or gastrula stage host embryo by choosing a transplantation site in the host embryo based on well-established fate maps.

A step-by-step guide to generating targeted chimeric zebrafish embryos by transplantation at the blastula or gastrula stage.

A criação de embriões quiméricos Zebrafish por Transplante

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Um método de alta taxa de transferência para Zebrafish criopreservação de espermatozóides e In Vitro Fertilização

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

Making Gynogenetic Diploid Zebrafish by Early Pressure

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from heterozygous females allow F1 mutagenized females to be screened directly for deleterious mutations in an accelerated forward genetic screen. Streisinger et al.1,2 described methods for making gynogenetic (homozygous) diploid zebrafish by activating zebrafish eggs with ultraviolet light-inactivated sperm and preventing either the second meiotic or the first zygotic cell division using physical treatments (heat or pressure) that deploymerize microtubules. The "early pressure" (EP) method blocks the meiosis II, which occurs shortly after fertilization. The EP method produces a high percentage of viable embryos that can develop to fertile adults of either sex. The method generates embryos that are homozygous at all loci except those that were separated from their centromere by recombination during meiosis I. Homozygous mutations are detected in EP clutches at between 50% for centromeric loci and less than 1% for telomeric loci. This method is reproduced verbatim from the Zebrafish Book3.

This is a method for generating gynogenetic diploid zebrafish embryos (embryos whose only genetic contribution comes from the mother) by blocking the second meiotic division immediately after fertilization with ultraviolet light-inactivated sperm. EP embryos are not fully homozygous due to recombination during the first meiotic division, however they are homozygous at all loci that have not been separated from their centromere by recombination.

Fazendo Zebrafish Diplóide Gynogenetic por pressão inicial

Heterozygosity in diploid eukaryotes often makes genetic studies cumbersome. Methods that produce viable homozygous diploid offspring directly from ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento de Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Criopreservação de embriões de camundongos por Vitrificação Etileno Glicol-Based

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Colheita e Cryo-resfriamento cristais de proteínas de membrana crescida no mesofases lipídicas para a determinação da estrutura de Cristalografia Macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell differentiation. Centrosomes are essential to determine the cell division axis during mitosis and to nucleate cilia during interphase. The identity of the proteins that mediate these dynamic changes remains only partially known, and the function of many of the proteins that have been implicated in these processes is still rudimentary. Recent work has shown that Drosophila spermatogenesis provides a powerful system to identify new proteins critical for centrosome function and formation as well as to gain insight into the particular function of known players in centrosome-related processes. Drosophila is an established genetic model organism where mutants in centrosomal genes can be readily obtained and easily analyzed. Furthermore, recent advances in the sensitivity and resolution of light microscopy and the development of robust genetically tagged centrosomal markers have transformed the ability to use Drosophila testes as a simple and accessible model system to study centrosomes. This paper describes the use of genetically-tagged centrosomal markers to perform genetic screens for new centrosomal mutants and to gain insight into the specific function of newly identified genes.

Imaging of centrosomal proteins during Drosophila spermatogenesis is a powerful method to identify new proteins critical for centrosome biology as well as to elucidate the particular function of known players in this process.

Centrossomas de imagem na mosca Testículos

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...