O objetivo geral do protocolo é isolar as células primárias de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos vivos. No nosso caso, isso foi coletado como janela cirúrgica durante a cirurgia. Isso é feito coletando inicialmente os tecidos cerebrais em PBS gelado, o tecido é então cortado em pequenos pedaços cubos de 1 mm, e eu só fiz com a ajuda da trippsina EDTA.
Depois disso, as células são colhidas por centrifugação e banhadas em um frasco adequado para a cultura das células andrógenas por 48 horas. As células são colhidas mais uma vez do frasco e cultivadas até o uso posterior. As células primárias de microglia humanas podem agora ser caracterizadas pelo uso de imunocytoquímica e usadas para mais experimentos.
A principal vantagem do nosso protocolo para isolar células de microglia de tecidos cerebrais humanos adultos é que ela fornece efetivamente células de microglia humanas adultas primárias de uma maneira muito econômica. O protocolo é robusto e reduz a perda de células reduzindo o número de etapas que estão sendo utilizadas nos protocolos existentes. Colete o tecido em um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL de gelo frio aCSF.
Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar. Descarte o aCSF cuidadosamente e pese tecido no tubo Falcão. Calcule o peso aproximado do tecido deduzindo o peso do tubo falcão vazio.
ACSF fresco quente a 37 graus centígrados. Mantenha o tecido aquecido aCSF por cinco minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.
Descarte aCSF cuidadosamente. E lave o tecido uma vez com 1X PBS aquecido a 37 graus centígrados. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS, conforme necessário.
Incubar o tecido em PBS quente por 5 minutos. Descarte metade do PBS cuidadosamente. Transfira tecido junto com o PBS restante para uma placa de Petri esterilizada.
Remova cuidadosamente o PBS restante com pipeta de 1 mL. Isso evitará a perda de tecido. Dados que emitem em pelo menos 1 mm cubo pequenos pedaços usando um bisturi estéril.
Adicione 2 mL de 0,25% de trippsina EDTA à placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Transfira o tecido picado para um tubo Falcon de 50 mL contendo 10 mL por grama de tecido de 0,25% de trippsina EDTA. Misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL.
Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 graus centígrados e a velocidade de 250 rpm. Adicione 10 mL de meio neutralizador para neutralizar a trippsina. Misture bem com uma pipeta sorológica de 10 mL.
Centrifugar o tubo a 2000G a 4 graus centígrados por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 1 mL de meio de cultura. Coloque as células em um frasco T25 adequado para células andrógenas e adicione 4 mL de meio de cultura adicional.
O meio cultural conterá 20%L929 sobrenante e 1%estreptomicina. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque. Terminamos com o frasco para descartar o tecido de forma homogênea.
Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação. Incubar o frasco a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Colete a mídia do frasco de cultura T25 preparado no dia 0 em tubos de centrífuga.
Centrifugar a mídia coletada a 1.466G a 4 graus centígrados por 4 minutos. Enquanto a mídia coletada está sendo centrifugada, lave o frasco do dia 0 uma vez com 1X PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados.
Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Descarte o supernatante de tubos centrifugados.
Adicione 1 mL de cultura média a um dos tubos e misture bem com pipeta. Adicione a mídia mista com células a outros tubos e misture bem. Coloque as células em um frasco T25 separado adequado para células andrógenas.
Adicione 4 mL de mídia de cultura fresca ao frasco. Incubar os frascos a 37 graus centígrados com 5% de CO2 por 48 horas. Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione mídia de cultura fresca de 5 mL.
Incubar os frascos a 37 graus centígrados a 5% de CO2 por 48 horas. No sexto dia, as células estarão prontas para mais experimentos. Nas imagens aqui representadas.
Primeiro painel da seção A astrócitos manchados com GFAP, de cor verde. No segundo painel, da seção A mancha de microglia com RCA, de cor verde. Na seção B microglia manchada com RCA, que é de cor verde, e os astrócitos são manchados com GFAP, de cor vermelha.
A sobreposição das imagens mostra microglia e astrócitos juntos. Fica claro pelas imagens que a maioria das células da cultura preparadas são microglia. As imagens foram quantificadas por controle cego e o resultado é representado na seção C.Os resultados mostraram que cerca de 80% das células da cultura preparada são células de microglia.
Esta técnica pode ser realizada em cerca de uma hora e meia. Após este procedimento deve ter uma boa compreensão de como eu seleciono microglia de tecidos cerebrais humanos adultos, que podem ser usados para experimentos a jusante.
