Os protocolos de núcleo Hi-C permitem a exploração da confirmação cromossômica em resolução diferente para a caracterização de laços de cromatina, domínios e compartimento organizando o genoma. Este protocolo fornece perfil de alta resolução de interações genômicas em diferentes escalas, gerando uma cobertura mais consistente sobre toda a gama de distâncias genômicas e dados com menos ruído técnico. Combinar este protocolo com a edição genética é uma estratégia poderosa para testar a função estrutural dos elementos genéticos.
Também pode ser aplicada à caracterização de variações estruturais que levam à doença. O protocolo de núcleo Hi-C pode ser aplicado para explorar a organização do genoma de qualquer genoma eucariótico. Fazer o tratamento SDS e Triton desagrega qualquer aglomerado nuclear por pipetação, pois os agregados interferem na eficiência da reação enzimática, e certifique-se de executar a medida de controles de qualidade apropriado antes do sequenciamento.
Comece adicionando formaldeído sem metanol a uma vezes 10 às sete células de Drosophila da Linha 2 Plus schneider em 17,5 mililitros de schneider médio suplementado com 10% FBS a uma concentração final de 2% Incubar as células por 10 minutos à temperatura ambiente com mistura a cada 60 segundos ou em uma roda giratória, e adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 molar com mistura. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente e 15 minutos no gelo, colete as células por centrifugação e resume cuidadosamente a pelota em 25 mililitros de PBS frio e colete as células com outra centrifugação. No final da centrifugação, resuspenge as células em um mililitro de tampão de lise gelada para contar e ajustar as células para uma única vezes 10 às seis células por concentração mililitro.
Incubar as células no gelo por 30 minutos, invertendo o tubo a cada dois minutos para misturar e coletar as células com outra centrifugação. Resuspenda a pelota em um mililitro de tampão de lise gelada fresca. Após a centrifugação, lave o lise com um mililitro de tampão de restrição de 1,25X.
Centrifugar novamente para coletar o lysate. Resuspenja a pelota em 360 microliters de tampão de restrição fresco e 11 microliters de 10% SDS com tubulação cuidadosa e incubação por 45 minutos a 37 graus Celsius e 7 a 950 revoluções por minuto com tubulação ocasional. No final da incubação, pare a permeabilização com 75 microlitadores de surfactante não iônico e devolva o tubo à incubadora por mais 45 minutos com agitação a 950 revoluções por minuto com pipetação ocasional.
Para digestão de cromatina, adicione 200 unidades de Mbo1 ao tubo para uma incubação de quatro a 16 horas a 37 graus Celsius com rotação. Ao final da incubação, inativar a enzima com incubação de 20 minutos a 60 graus Celsius. Para preencher as pendeções do fragmento de restrição e rotular as extremidades de DNA com biotina, adicionar 1,5 microliters cada um de 10 mililitros dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitres de 0,4 milimolar biotina dATP, 17,5 microliters de três baixos buffer EDTA, e 10 microlitres de cinco unidades por microliter de DNA polimerase um grande fragmento para o tubo com mistura cuidadosa.
Incubar a reação por 75 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 700 revoluções por minuto a cada 10 segundos por 30 segundos. No final da incubação, adicione a mistura de ligadura à cromatina e ajuste-a a um mililitro volume final de reação com mistura suave e incubada durante a noite a 16 graus Celsius. Para degradar as proteínas da amostra, adicione 50 microlitadores de 10 miligramas por mililitro proteinase K ao tubo para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius.
No final da incubação, aumente a temperatura para 65 graus Celsius durante a noite para reverter o cruzamento da amostra. Na manhã seguinte, degrade o RNA com 10 microlitres de 10 mililíberos por mililitro RNAse A.Após uma hora a 37 graus Celsius, adicione um volume de clorofórmio fenol ao tubo e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea. Depois de precipitar o DNA de acordo com os protocolos padrão, quantifique o DNA usando um corante fluorogênico que se liga seletivamente ao DNA e um fluorômetro de acordo com as instruções do fabricante.
Para purificar o DNA de alíquotas não digeridas e digeridas, carregue 100 nanogramas de amostras não digeridas, digeridas e ligadas em um gel de 1,5% de ágarose e procure por uma mancha centrada em cerca de 500 pares de base na amostra digerida versus uma faixa de alto peso molecular para a amostra ligada. Para verificar a marcação hi-C e eficiência de ligadura por amplificação e digestão de uma interação conhecida, após PCR, digerir os produtos com Mbo1, Cla1, ou ambos, e executar as amostras em um novo gel de 1,5 a 2% para permitir a estimativa do número relativo de junções de ligaduras 3C e Hi-C. Depois de sonicar a amostra para obter 200 a 500 fragmentos de DNA do par base, transferir 130 microliters com cinco microgramas de DNA de cada amostra para novos tubos de microcentrífa contendo 16 microliters de tampão de ligadura 10X, dois microlitres de 10 milimolares dATP, cinco microlitradores de polimerase de DNA T4, e sete microliters de água dupla destilada para uma incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius.
No final da incubação, adicione cinco microlitadores de 10 dNTPs mililitros, quatro microliters de tampão de ligadura 10X, cinco microlitrais de quinase de polinucleotídeo T4, um microliter de polimerase de DNA um grande fragmento, e 25 microliters de água dupla destilada aos tubos para uma segunda incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius. Para selecionar fragmentos principalmente na faixa de tamanho do par base de 250 a 550, realize a seleção de tamanho reversível de fase sólida sequencial e de tamanho de mobilização com 0,6X, depois 0,9X de acordo com as instruções do fabricante e elute o DNA com 100 microliters de tris low EDTA. Para puxar biotina para cada biblioteca, lave 150 microliters de contas magnéticas ligadas a Streptavidin duas vezes com 400 microliters de tampão 1X Tween e gire as amostras por três minutos em uma roda giratória.
No final da incubação, resuspenja as contas em 300 microliters de tampão 2X no Tween e misture com 300 microliters de material Hi-C para uma rotação de 30 minutos em uma roda giratória. No final da incubação, lave as contas com 400 microliters de tampão 0,5X Tween para uma incubação de três minutos a 55 graus Celsius e 750 rotações por minuto, seguida por duas lavagens em 200 microliters de tampão de restrição 1X por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenque as contas em 100 microliters de mistura de rejeito dATP para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.
Ao final da incubação, resuspenque as contas em 50 microliters de tampão de ligadura 1X e transfira a suspensão para um novo tubo contendo quatro microliters adaptadores finais emparelhados pré-annealed e dois microliters de ligadura T4. Depois de duas horas em temperatura ambiente, remova o supernatante e lave as contas duas vezes com 400 microliters de tampão de interpolação, depois lave as contas uma vez com 200 microliters sem tampão de Interpol e uma vez com 100 microliters de tampão de restrição antes de suspender novamente as contas em 40 microliters de tampão de restrição 1X. Uma mancha de 200 a 1.000 pares de base é observada quando a restrição com Mbo1 é bem sucedida.
Se a ligadura for bem sucedida, uma faixa de alto peso molecular é observada no topo do gel. A eficiência de digestão também pode ser confirmada por PCR quantitativo. Uma eficiência de digestão aceitável é de 80% ou mais.
Como ilustrado, a amplificação de uma interação conhecida de média gama em produtos de ligadura Hi-C pode ser estimada pela digestão do produto PCR recuperado na amplificação. Recomenda-se uma eficiência de digestão superior a 70% para evitar ter uma grande proporção de leituras não úteis para as bibliotecas após o sequenciamento. O número de ciclos de PCR para a amplificação final deve ser um ciclo menor do que o número de ciclos para os quais a mancha é visível.
O nível de digestão da biblioteca indica a abundância de pares Hi-C válidos e reflete a proporção de leituras úteis que serão obtidas da biblioteca. Utilizando os pares Hi-C válidos exclusivos, a análise básica da distribuição do par pode ser realizada. Como observado neste exemplo representativo, o lócus genético NOTCH pode ser visto juntamente com as proteínas arquitetônicas, domínios um e dois, e modificações histonas ao longo do lócus.
Após a exclusão da região contendo os locais de ligação de DNA CTCF e M1BP, uma mudança drástica nos contatos de cromatina pode ser observada. Após o experimento Hi-C, pode ser realizado um conjunto específico de contatos, por exemplo, de regiões promotoras. Isso é particularmente útil na avaliação de genomas grandes.
Como demonstrado, a combinação do protocolo Hi-C com a adição genética pode ser usada para avaliar a função estrutural e regulatória dos elementos genômicos.
