Este protocolo permite que os pesquisadores esclareçam o comportamento planário e os mecanismos de sec subjacentes a esse comportamento, combinando análises comportamentais quantitativas com perturbações moleculares e químicas. Esta técnica é facilmente acessível a todos os níveis de habilidade, pois não requer instrumentos avançados ou software especializado para obter leituras comportamentais quantitativas de planários em movimento gratuitos. O esmagamento pode ser usado para estudar exceção em planários, e serve como ponto final sensível para o ensaio, interrompendo a função do sistema nervoso causada por xenobióticos e doenças.
Comece colocando um painel LED dimmable sobre uma superfície plana, que fornecerá um fundo branco uniforme e pode ser usado como uma fonte de luz ajustável para obter o contraste apropriado. Coloque uma arena de placas de Petri de 100 milímetros no painel LED. Monte uma câmera em um suporte de anel acima da arena e ajuste sua posição, altura e foco conforme necessário para que toda a arena esteja centrada dentro do campo de visão e esteja em foco.
Encha a arena com aproximadamente 25 mililitros da mídia de exposição apropriada para ter volume máximo, ligue o painel LED e desligue quaisquer outras fontes de luz que possam afetar negativamente a qualidade do registro. Largue um planário no centro da arena usando uma pipeta de transferência. Ao testar uma solução química, transfira o planário com o mínimo de água planariana possível, para que a concentração do produto químico não seja significativamente alterada.
Comece a gravar dados como sequências de imagem em um formato nativo de Fiji. Para experimentos de deslizamento, grave de um a dois minutos de comportamento deslizante, para experimentos de scrunching ou peristalse, regise tempo suficiente para capturar pelo menos três oscilações consecutivas ocorrendo em linha reta. Assim que o experimento estiver concluído, termine a gravação.
Se o planário chegar ao limite da arena sem satisfazer o critério de rescisão, pipeta o planário de volta ao centro da arena. Abra a sequência de imagem bruta para um experimento em Fiji, converta-a em oito bits e use a ferramenta de seta ou controle deslizante na parte inferior da pilha de imagens para passar pela sequência de imagem. Para extrair um período de tempo e região de interesse, desenhe uma região de interesse que abrange todo o caminho de um planário usando a ferramenta retângulo.
Clique com o botão direito do mouse na pilha de imagens e selecione duplicata, marque a caixa onde pilha duplicada. Digite o primeiro e último quadros da sequência de interesse e clique bem. Para experimentos de deslizamento, extraia um período de deslizamento onde o planário move pelo menos o dobro de seu comprimento corporal para experimentos de scrunching ou peristose.
Extrair uma instância quando o planário sofrer um mínimo de três oscilações corporais consecutivas e completas em linha reta. Aplique um limiar à pilha de imagens duplicada para binarizar a imagem e extrair o planário do fundo, ajuste as barras deslizantes para que todo o planário seja destacado em vermelho. Os valores exatos dependem da qualidade da imagem.
Deixe as caixas para fundo escuro, empilhe histograma e não reinicie o intervalo sem controle. Role a pilha de imagens para garantir um bom alcance de limiar e clique em aplicar. Na pilha de conversão para janela binária, defina o método como padrão e o fundo para a luz.
Desmarque todas as caixas nesta janela e clique bem. Uma imagem binarizada mostrando um planário preto em um fundo branco aparecerá. Certifique-se de que todo o planário esteja visível em todos os quadros da sequência de imagem.
Defina as medidas clicando em analisar e definir medidas. Verifique as caixas para se ter área, centro de massa, posicione a posição da pilha e encaixe a elipse, em seguida, clique bem. Selecione a pilha de imagens abertas e selecione analisar e analisar partículas.
Na janela de partículas de análise, selecione show e máscaras para abrir uma nova pilha mostrando todos os objetos que foram detectados com os parâmetros escolhidos. Defina um filtro de tamanho para remover ruídos indesejados entrando na área aproximada do planário. Em seguida, verifique se as caixas estão com resultados de exibição e resultados claros e clique bem.
Passe a pilha de imagens da máscara usando o controle deslizante na parte inferior do Painel para ter certeza de que não há ruído ou quadros sem um planário. Na janela de resultados, salve os dados usando arquivo e salve como, adicione a extensão CSV ao nome do arquivo, para salvar os dados como valores separados por círia. Uma vez salvos os dados da pilha de imagens, feche os respectivos resultados da pilha de imagens e mascara janelas.
Para induzir o esmagamento através da temperatura nociva, aqueça a água planária em um copo de vidro a 65 graus Celsius em uma placa quente. Coloque um planário no centro da arena, e espere até que ele se oriente ereto e comece a deslizar, então comece a gravar. Use uma Pipeta P 200 para in pipetar lentamente e consistentemente 100 microliters da água planária pré-aquecido, pós faringeal na extremidade traseira do planário para induzir o scrunching.
Pare a gravação, uma vez que o scrunching cessou. Coloque o planário em um recipiente de recuperação e troque a mídia na placa de Petri com água planária de temperatura ambiente fresca, se realizar mais experimentos. Para induzir o scrunching via amputação, transfira um planário para o centro da arena e espere até que o planário se oriente ereto e comece a deslizar.
Então comece a gravar, ampute o planário com uma lâmina de barbear limpa. Certificando-se de que o local do corte é consistente entre experimentos. Pare a gravação assim que a peça anterior parar de amassar.
Retire ambas as peças, coloque-as em um recipiente separado e deixe-as se regenerar por sete dias. Planários amputados podem ser reincorporados no recipiente doméstico assim que se regenerarem. Este protocolo foi usado para testar se perto da exposição à luz UV, induz o esmagamento em S.mediterranea e planários d.japonica, enquanto os planários d.japonica scrunch, quando expostos à luz UV perto, planários S.mediterranea ou exibem desbasamento de cauda ou nenhuma resposta.
Uma quantificação dos parâmetros de scrunching para os planários D.japonica que exibiram pelo menos três scrunches consecutivos em linha reta, revela características de parâmetros de scrunching para esta espécie Em contraste exposição a 250 micromolar cinnamaldeído desconhecido TRPA um agonista em camundongos, causa scrunching e S.medineaterra. Considerando que os planários d.japonica exibem uma mistura de movimento parecido com cobra e oscilação interrompida por deslizamentos ou curvas vigorosas na cabeça. Uma quantificação das amostras com pelo menos três oscilações consecutivas, rendeu valores significativamente mais baixos para três dos quatro parâmetros então esperados para scrunching em D.japonica, indicando que o movimento oscilatório observado não é scrunching.
A RNAi confirma a especificidade do scrunching e a resposta à exposição ao cinnamaldeído em S.mediterranea. Dentro de 180 segundos de exposição na água planária, todos controlam o planário RNAi. Em comparação com nenhum dos planários da SMTRPA um RNAi demonstrando que s.mediterranea scrunching em cinnamaldeído requer SMTRPA um.
É essencial ser consistente e como os animais são manipulados para reduzir o ruído e garantir a reprodutibilidade nas medidas comportamentais. Esses projetos podem ser expandidos para incluir a análise de forma corporal, o que permitiria a identificação e quantificação de outros comportamentos planários que não são capturados aqui.
