Este protocolo otimizado melhorou a geração de precursores de células beta pancreáticas a partir de células-tronco pluripotentes humanas, que podem ser usadas para terapia celular para diabetes e investigando mecanismos moleculares que sublinham a biogênese do diabetes. Esta é uma técnica viável, pois é usada para culturas monocamadas 2D. É fácil de aplicar e é consistente em várias linhagens de células-tronco pluripotentes de controle e derivadas do paciente.
Esses precursores de células beta, quando transplantados em um paciente diabético, podem amadurecer em células beta secretoras de insulina e podem potencialmente reverter a hiperglicemia. Portanto, o aumento das porcentagens de progenitores pancreáticos gerados usando nosso protocolo pode ser usado para terapia celular para diabetes. Este protocolo aprimorado pode ser usado para estudar o desenvolvimento pancreático humano precoce em indivíduos saudáveis, bem como em pacientes diabéticos, o que é um desafio devido à escassez de amostras de tecido.
Quando as células-tronco pluripotentes humanas ou colônias de hPSC tiverem atingido 70 a 80% de confluência, lave-as duas vezes com PBS quente dentro do capuz de cultura de tecidos. Em seguida, aspirar o tampão usando um aspirador de vácuo portátil. Em seguida, adicione o meio de diferenciação do estágio um contendo CHIR-99021 às colônias e incube a placa a 37 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, substitua a mídia gasta pelo meio de diferenciação do estágio um sem CHIR-99021. Depois de aspirar o meio gasto e lavar as células endodérmicas definitivas duas vezes com PBS quente, gire a placa para remover quaisquer detritos celulares. Em seguida, fixe as células adicionando 4% de paraformaldeído e coloque a placa em um agitador bidimensional.
Após a fixação, lave as células com solução salina tamponada com TRIS contendo 0,5% de Tween e coloque a placa no agitador. Em seguida, permeabilize as células fixas adicionando uma quantidade generosa de PBS contendo 0,5% de Triton X-100 e coloque a placa de volta no agitador. Em seguida, adicione o tampão de bloqueio recém-preparado às células permeabilizadas e incube a placa por uma hora no agitador.
Em seguida, adicione anticorpos primários diluídos às células bloqueadas e coloque a placa no agitador a quatro graus Celsius com agitação suave. No dia seguinte, após a aspiração da solução primária de anticorpos, lave os poços três vezes com TBST por 10 minutos cada um no agitador. Em seguida, adicione os anticorpos secundários.
Cubra a placa com papel alumínio para proteger da luz e coloque a placa no agitador à temperatura ambiente durante uma hora. Em seguida, aspirar a solução de anticorpos secundários e lavar os poços corados com TBST no agitador por 10 minutos, mantendo a placa coberta com papel alumínio. Em seguida, para manchar os núcleos, adicione a solução Hoechst aos poços e coloque a placa no agitador.
Após dois a três minutos, aspirar a solução Hoechst e enxaguar os poços duas vezes com PBS. Finalmente, adicione PBS às células coradas e visualize-as usando um microscópio de fluorescência invertida no escuro. No primeiro dia do estágio dois, dissociar as células endodérmicas derivadas de hPSC primeiro lavando-as com PBS quente e, em seguida, adicionando um mililitro de solução enzimática quente por poço de uma placa de seis poços.
Coloque a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por três a cinco minutos ou até que as células comecem a se separar umas das outras. Dissociar as folhas separadas ou a monocamada de células nos poços e coletar as células separadas juntas em um tubo de polipropileno de 15 mililitros usando meio de estágio basal. Em seguida, gire as células para baixo, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet usando um mililitro de PBS estéril.
Depois de contar as células usando um contador automatizado, gire as células novamente e descarte o sobrenadante. Em seguida, ressuscite o pellet no volume apropriado do meio de diferenciação do estágio dois contendo um inibidor de rocha. Chapear as células ressuspensas em uma a 50 placas revestidas de matriz de membrana e incubá-las a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após 24 horas, substitua o meio pelo meio de diferenciação do estágio dois sem o inibidor de Rock. No final do estágio quatro, desprenda as células, como demonstrado anteriormente, e colete-as em um tubo de 15 mililitros. Em seguida, gire as células, descarte o sobrenadante, lave as células com PBS e dissocie-as em células únicas.
Depois de contar as células usando um contador de células automatizado, gire as células novamente e ressuspenda a pelota em 200 microlitros de PBS resfriado. Em seguida, adicione dois mililitros de etanol refrigerado a 80% com o tubo em um vórtice definido de baixa a média velocidade. Feche a tampa com força e coloque o tubo ligeiramente inclinado sobre o agitador a quatro graus Celsius durante a noite.
No dia seguinte, gire as células e lave o pellet com PBS para dissociar quaisquer aglomerados de células fixas. Em seguida, bloqueie as células fixas por pelo menos uma hora à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius durante a noite no agitador. Em seguida, para corar os marcadores progenitores pancreáticos, distribua 200.000 células por condição, incluindo controles isotípicos apropriados, controles de anticorpos não corados e secundários em uma placa inferior de 96 poços V.
Em seguida, gire a placa brevemente e vire a placa com um movimento rápido para descartar o sobrenadante sem perder os pellets. Em seguida, incube as células em anticorpos primários por pelo menos duas horas à temperatura ambiente em um agitador com agitação suave. Em seguida, lave as células coradas três vezes com TBST, pipetando para cima e para baixo nos poços.
Centrifugar as células novamente, descartar o sobrenadante e adicionar anticorpos secundários às células. Após uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, lave as células coradas duas vezes com TBST. Em seguida, gire a placa, colete as células coradas em 100 microlitros de PBS em tubos de fax protegidos contra luz e execute as amostras em uma máquina de citometria de fluxo.
Em comparação com o método não otimizado, o protocolo otimizado aumentou a eficiência de diferenciação do progenitor pancreático regulando positivamente a co-expressão PDX 1 e NKX 6.1. Em particular, a dissociação das células endodérmicas e seu replating na matriz de membrana fresca, juntamente com uma duração mais longa do estágio três, aumentaram a expressão de NKX 6.1 em progenitores pancreáticos derivados de hPSC em comparação com o protocolo não dissociado. Os progenitores pancreáticos gerados usando o protocolo otimizado também aumentaram o número de células positivas para SOX9 em comparação com o método não dissociado.
Além disso, o método otimizado também gerou uma maior proporção de células proliferativas positivas para NKX 6.1 que co-expressaram o marcador de proliferação Ki67. A fim de aumentar a eficiência, é crucial dissociar a endoderma derivada da HbA1 e, em seguida, estender a duração do tratamento do estágio três com sinalização amiloide FGF e inibição do ouriço. A geração escalável de progenitores pancreáticos usando este protocolo aprimorado facilitou estudos sobre a melhoria da eficiência e maturação de células beta pancreáticas derivadas de células-tronco pluripotentes humanas e permitiu a modelagem de diferentes tipos de diabetes.
