Este trabalho foi financiado pela Universidade de Western Ontario, no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, e uma bolsa ER06-02-188 a partir da Pesquisa MINISTÉRIO e Inovação, Prêmio Pesquisador precoce. MMD foi apoiada por um programa de treinamento CIHR em Reprodução, Desenvolvimento precoce eo Impacto na Saúde Bolsas de Pós-Graduação (REDIH).

DIA 1 Prepare as seguintes soluções frescas no dia da coleta de oócitos com água destilada estéril como GIBCO água. Para reduzir a chance de contaminação de DNA, mudar frequentemente e usar luvas de pontas com filtro. Manter tubos angular longe quando aberto, e recapitular todos os tubos quando não em uso. Sugerimos que as soluções são feitas como se n +1. 3% de agarose LMP 30 mg baixo ponto de fusão (LMP) Agarose até 1 ml de H2O GIBCO dissolver @ 70 ° C Solução de lise 8 ul de tampão de lise 1 uL de proteinase K 1 uL de 10% IGEPAL lugar em gelo até estar pronto para utilização 02:01 Agarose: solução de lise (10 uL por oócito indivíduo, a quantidade é de 3 oócitos) 20 ul de 3% de agarose LMP 10 ul da solução de lise misturar @ 70 ° C Ly SDSsis tampão (501 ul por oócito individual) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> 50 uL </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td></td><td> 501 ul </td></tr></tbody></table> 1. Recolha de ovócitos <ol><li> Coloque os ovidutos rato dissecadas em mídia M2, e rasgar a ampolas para extrair o complexo de células cumulus. </li><li> Separa-se os oócitos a partir do complexo de células do cumulus usando 0,3 mg / ml em solução de hialuronidase uma queda de 30 uL de meios M2. Manter os oócitos em solução apenas enquanto que leva para remover as células do cumulus, como a exposição prolongada pode danificar. Lave os oócitos em 3x a queda de 30 ul de mídia M2, removendo as células cumulus periodicamente. </li><li> Remover a zona pelúcida utilizando uma solução ácida de Tyrode. Coloque os oócitos em uma queda de 30 ml de solução em primeiro lugar, e depois transferir para outras 30gota ul, como quaisquer meios transportados ao longo irá diluir o ácido e reduzir a sua eficiência. Manter os oócitos em solução apenas enquanto que leva para remover a zona, como a exposição prolongada pode danificar. Nota: um aumento da concentração de solução ácida de Tyrode ou pronase podem ser utilizados para amostras humanas, tal como o ser humano zona pelúcida é mais resistente ao tratamento com solução ácida de Tyrode do que o rato. </li><li> Lavar os oócitos mais uma vez em uma queda de 30 uL de meios M2. </li></ol> 2. Agarose Embedding e Lise <ol><li> Para realizar a incorporação de agarose, colocar a solução de lise em um 70 ° C heatblock. Adicionar o pré-aquecido LMP de agarose para a solução de lise, produzindo um agarose 02:01: solução de lise. </li><li> Coloque um único óvulo numa lâmina de vidro limpa no mínimo mídia M2. Tome-se 10 uL da agarose: solução de lise numa ponta de pipeta, e (sob um microscópio) suavemente expelir uma pequena quantidade (~ 1 uL ou menos) para a lâmina de vidro, permitindo que ele se misturar com o minimal mídia. Levante com cuidado o oócito na ponta da pipeta e colocar todos os ul 10 em um tubo Eppendorf com 300 uL de óleo mineral para o talão forma uma esfera. Nota: este processo tem de ser feito muito rapidamente como a agarose vai endurecer se a temperatura descer tão pouco como 5 ° C abaixo de 70 ° C. </li><li> Incubar o tubo em gelo durante 10 minutos. Para realizar a lise, remover o óleo mineral 300 uL e adicionar 500 uL de tampão de lise SDS. Incubar durante uma noite em um banho de água 50 ° C. Nota: solução de lise (Tabela 1) podem também ser utilizados para esta finalidade. </li></ol> DIA 2 Preparar as seguintes soluções frescas no dia da mutagénese bissulfito. Para reduzir a chance de contaminação do DNA, mudar frequentemente e usar luvas de pontas com filtro. Manter tubos angular longe quando aberto, e recapitular todos os tubos quando não em uso. Sugerimos que as soluções são feitas como se n +1. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M de NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g de NaOH em ​​20 ml autoclavado ddH2O </td></tr><tr><td> 0,1 M de NaOH </td><td> 0,5 ml de 3M em 14,5 ml autoclavado ddH2O </td></tr><tr><td> 0,3 M de NaOH </td><td> 1,5 ml de 3M em 13,5 ml autoclavado ddH2O </td></tr></tbody></table> Solução 2,5 M Bissulfito <ol class="lalpha"><li> 3,8 g de bissulfito de sódio 5,5 ml GIBCO H2O destilada 1 ml NaOH 3 M dissolver @ temperatura ambiente </li><li> 110 mg Hidroquinona 1 ml GIBCO H2O destilada dissolver @ 90 ° C (apenas durante o tempo que leva a dissolver-se, misturar regularmente) </li></ol> Quando completamente dissolvido, misturar a solução (a) e (b) * Mantenha longe de luz * 3. Mutagênese Bissulfito <ol><li> Remover completamente a 500 uL de tampão de lise de SDS e adicionam-se 300 uL de óleo mineral (~ 20 horas). Qualquer tampão de lise restante irá diluir the agarose quando é aquecido ea esfera será mais susceptível a dissolução nos passos subsequentes. Prosseguir com mutagénese bissulfito imediatamente, ou armazenar a -20 ° C durante até 5 dias. </li><li> Se for o caso, remova os oócitos do congelador e deixe descongelar (somente até agarose grânulo é relativamente translúcido). Incubar durante 2,5 minutos num bloco de aquecimento 90 ° C, após o que Incubar em gelo durante 10 minutos. Nota: Não misturar ou agitar, estender mais do que 2,5 minutos, ou flutuar temperatura. </li><li> Para realizar a desnaturação, remover o óleo mineral e adicionar 1 ml 0,1 M de NaOH para cada tubo de filme, e inverter 5-6 vezes. </li><li> Incubar durante 15 minutos num banho-maria a 37 ° C, invertendo a cada 3-4 minutos. O grânulo deve flutuar no NaOH. </li><li> Para realizar tratamento com bissulfito, girar suavemente o tubo, em seguida, remover o NaOH e adicionar 300 ul de óleo mineral e 500 solução de bissulfito ul. Incubar o tubo para 3,5 horas a 50 ° C em banho. * Mantenha longe de luz * </strong&gt; Nota: Comprimento de incubação pode precisar de ser determinada empiricamente para o gene de interesse. </li><li> Para executar dessulfonação, incubar em gelo durante 3 minutos, em seguida remover o óleo mineral e da solução de bissulfito, girar suavemente, e adicionar 1 ml 0,3 M de NaOH. Flick e inverter 5-6 vezes. </li><li> Incubar durante 15 minutos num banho-maria a 37 ° C, invertendo a cada 3-4 minutos. O grânulo deve flutuar no NaOH. </li><li> Lavar as amostras, por fiação primeiro suavemente, em seguida remover o NaOH e adicionar 1 ml 1x TE pH 7,5. Agitar durante 5-10 minutos à temperatura ambiente (num agitador). Gire suavemente novamente, em seguida, remova o TE 1x. Repetir este processo de lavagem duas vezes. </li><li> Adicionar 1 ml autoclavado DDH 2 O. Agitar durante 5-10 minutos à temperatura ambiente (num agitador). Gire suavemente, em seguida, remover o H 2 O. Repita DDH 2 lavagem O duas vezes. </li><li> Verificar o pH do sobrenadante, que deve ser 5,0 pH. Se ainda demasiado básico, lavar novamente com H2O Remova todo o sobrenadante, deixando apenas a ser agaroseanúncio. </li></ol> 4. 1 ª e 2 ª Rodada de amplificação por PCR <ol><li> Prepare 1 ª rodada ** PCR mix enquanto lava ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 Primer mM Encaminhar Exterior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 Reverso Primer mM Exterior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 13 ul </td></tr></tbody></table> Adicionar ao Illustra Ready-to-Go Hot contas de início de PCR Deslize cuidadosamente o sólido agarose esferas dentro do tubo de PCR (~ ul 10) Aquecer até 70 ° C e misturar Adicionar 25 ul de óleo mineral Total: 50 ul <ol start="2"><li> Amplificar Nota: Um exemplo de condições de ciclismo para mouse SNRPN é desnaturação durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1minutos a 68 ° C, e um passo final de 10 minutos de alongamento a 68 ° C. Recozimento temperatura para 1 º ciclo de PCR para mouse e H19 Peg3 é de 50 ° C. </li><li> Prepare 2 ª rodada PCR mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 Primer mM Encaminhar Interior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 Reverso Primer mM Interior </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 19 ul </td></tr></tbody></table> Adicionar ao Illustra Ready-to-Go Hot contas de início de PCR Adicionar 5 ul 1 produto Rodada st como um modelo. Aquecer o produto 1 r rodada a 70 ° C durante 1 minuto para amolecer a agarose. Certifique-se de pipetar abaixo da camada de óleo mineral. Adicionar 25 ul de óleo mineral Total: 50 ul Nota: sequências de primers aninhados para SNRPN, H19, e Peg3 pode ser encontrado no Mercado Velker et al 10,12. <ol start="4"><li> Amplificar Nota: As condições de amplificação para o rato é SNRPN desnaturação durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, e 1 minuto a 68 ° C, e um alongamento final de 10 minutos passo a 68 ° C 10. Rato H19 e Peg3 requerem uma a 50 ° C de temperatura para recozimento 2 nd ciclo de PCR. </li><li> Como um teste de diagnóstico, a segunda amostras redondas pode ser cortada com uma enzima de restrição que é a metilação ou estirpe específica. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª Rodada de produto </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Enzima de Restrição </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Tampão </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Electroforese dos produtos de digestão num gel de acrilamida a 8%. Todas as bandas heterogêneos representar mais de um Sequence. </li></ol> 5. TA Clonagem e Colônia PCR <ol><li> Para clonar 2 produto nd rodada, o calor primeiro a 70 ° C durante 1 minuto para amolecer a agarose, em seguida, ligadura no vector utilizando o Promega pGEM-T Vector System (Fisher Scientific Cat # A1360). </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª Rodada de PCR </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> pGEMT-EASY vector </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Ligase </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 2 uL </td></tr><tr><td> Tampão de ligação 2x </td><td> 5 ul </td></tr></tbody></table> Incubar durante a noite @ 4 ° C em máquina de PCR. <ol start="2"><li> Descongelar as células competentes de E. coli em gelo durante 15 minutos (Zymo Research Cat # Corp T3009). Adicionar 3 reacção de ligação uL de 8 uL E.coli e ligadura incubar em gelo durante 15 minutos. </li><li> Choque térmico durante 40 segundos em um banho-maria 42 ° C,e incubar em gelo durante 2 minutos. Adicionar 60 ul meio SOC e incubar a 37 ° C durante 1 hora (em agitador). </li><li> Coloque toda a mistura de reacção sobre uma placa de agar LB / / IPTG / Xgal / Amp e placa incubar a 37 ° C durante a noite. </li><li> Prepare mix colônia PCR </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 mM primer forward M13 </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 20 uM iniciador reverso de M13 </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 5X Verde Go Taq Buffer de </td><td> 7,0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM de dNTP </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerase </td><td> 0,28 ul </td></tr><tr><td> H 2 S </td><td> 25,62 ul </td></tr><tr><td></td><td> 35 Total ul </td></tr></tbody></table> Adicionar 35 ul Colony PCR master mix em um tubo de PCR. Escolha uma colónia branca bacteriana a partir da placa com uma ponta de pipeta, e agite-lo para a reacção de PCR. <ol start="6"><li> Amplificar com a desnaturação durante 10 minutos a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, e 1 minuto a 72 ° C, e um passo final de alongamento 10 minutos a 72 ° C. Electroforese 4 uL sobre um 1,5% de gel de agarose. Enviar ~ uL 30 do produto de PCR para a sequenciação. Nota: Para oócitos, 5 produtos de PCR de colônia são seqüenciados. </li><li> Uma vez que os resultados de sequenciação são obtidos, padrões de metilação pode ser lido. Qualquer CG original que se manteve como um CG foi metilado, e qualquer CG original, que é agora uma TG foi não metilado. </li></ol> 6. Os resultados representativos No nosso trabalho, nós ensaio impressa metilação em oócitos individuais e embriões (Figura 1). Após amplificação por PCR aninhada utilizando iniciadores bissulfito convertidos, é possível confirmar uma conversão bem sucedida, visualizando um tamanho do fragmento correcto sobre um gel de agarose (Figura 2). Um oócito indivíduorepresenta um alelo parental, e em teoria, tem um padrão de metilação impresso. Como tal, segundo ciclo de PCR produtos podem ser testados para a contaminação não intencional. Uma enzima de restrição sensíveis à metilação de DNA (como HinfI ou DpnII) pode ser usado para digerir o segundo produto de PCR rodada para avaliar se ele contém um alelo metilado ou não metilado (Figura 3). Um C metilado no interior da sequência de reconhecimento da enzima é clivado, enquanto um C não metilado que é convertido em T não é reconhecido pela enzima e é cortada. Qualquer amostra de oócitos MII contendo ambos os alelos metilados e não metiladas deve ser descartado, uma vez que é indicativo de contaminação cumulus celular (Figura 3). Após ligação e transformação, bem sucedida colónia de amplificação por PCR podem ser visualizados num gel de agarose para assegurar as amostras com o tamanho do produto correcto são enviados para a sequenciação (Figura 4). Finalmente, a seqüência de cinco cl indivíduomais de um ovócito MII deve produzir cinco padrões de metilação idênticos e as taxas de conversão nonCpG idênticos (Figura 5A). Qualquer amostra que contêm mais do que um padrão deve ser eliminada (Figura 5b). Uma vez que os oócitos ovulados MII tem duas cópias do cromossoma ou um corpo em anexo polar, existe uma possibilidade para a obtenção de dois padrões de sequência semelhante (Figura 5C). Recomendamos descartando dados a partir de oócitos que têm padrões de metilação altamente desiguais desde a contaminação de células cumulus não pode ser descartada. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do único ensaio de mutagênese Oocyte Bissulfito. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados representativos de 2 ª rodada de amplificação para SNRPN de um cantarle oócito MII em um gel de agarose 1,5%. As pistas 1-4 são quatro oócitos individuais Mii e pista 5 é um controle negativo (sem oócito). Tamanho amplicon esperado para SNRPN é de 420 pb. Escada L,. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> Figura 3. Os resultados representativos de digestão de restrição 2 nd rodada-metilação específico para SNRPN a partir de um oócito MII única em um gel de acrilamida a 8%. HinfI digestão de restrição de diagnóstico mostra ADN não metilado que abriga um T que suprime o local de restrição (420bp, pista 1) ou ADN metilado que contém um local de reconhecimento C dentro de (corte, 262, 103, e 54 pb, pista 2). Digestão mostrando locais de restrição tanto metilados e não metilado enzima de bandas de corte e não cortada, pista 3) são indicativos de contaminação de células do cumulus. Escada L,. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Figura 4. </strong&gt; Os resultados representativos para a amplificação por PCR de colónias para SNRPN a partir de um oócito MII única em um 1,5% de gel de agarose. Tamanho amplicon esperado após a ligadura do SNRPN no vetor pGEM-T Easy e usando M13 forward e primers reversos é 656 bp. Pista 1-8, amplicões a partir de clones 1-8. Clone 5 tem um tamanho de fragmento amplificado incorrecta e não deve ser enviada para a sequenciação. <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Figura 5. Representativas sequenciação resultados para SNRPN a partir de um oócito MII único. SNRPN é metilado em oócitos. Círculos pretos indicam CpGs metilados. Círculos brancos indicam CpGs não metiladas. Número de CpG e colocação é representativo para um rato B6 estirpe feminina. a) Esperado sequenciação resultados para SNRPN a partir de um oócito MII único. Apenas um cordão único de DNA deve amplificar em todos os cinco clones. Oócitos com um único padrão de metilação e patter conversão idêntica não CpGn devem ser incluídos nas análises (percentagem de conversão de não-CpGs indicado à direita foi calculada como o número de não-CpG citosinas convertidos para timina como uma percentagem do total não-CpG citosinas). b) resultados de sequenciação para SNRPN a partir de um ovócito MII único com a contaminação de células cumulus. Observe a dessemelhança entre os estados de metilação e padrões de conversão, indicando amplificação vertente múltipla. c) Seqüenciamento resultados para SNRPN a partir de um ovócito MII única com ambas as cópias do cromossoma ou inclusão corpo polar.

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. 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Os autores não têm nada a revelar.

Este ensaio único óvulo contém muitas etapas com um número que são críticas e requerem cuidados especiais. A primeira é a lavagem do oócito. É particularmente importante para lavar cada oócito várias vezes em meio fresco cai após o tratamento hialuronidase para remover as células do cumulus tantas quanto possível. Além disso, quando a transferência de ovócitos a solução ácida de Tyrode para zona pelúcida remoção certifique-se envolvente meio é claro de células do cumulus. O oócito é muito pega...

Tabela de reagentes específicos e equipamentos. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td colspan="4"> Recolha de ovócitos </td></tr><tr><td> Hialuronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Ácida de Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> IGEPAL 10% </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solução de lise </td></tr><tr><td> Tris pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LIDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS Tampão de Lise </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Conversão Bissulfito </td></tr><tr><td> Hidróxido de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Hidrogenossulfito de sódio (bissulfito de sódio) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hidroquinona </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> Meio M2 </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO água destilada </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclavado duas vezes água destilada (dd) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Iniciar Hot Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml de levedura tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de reacção 5x Verde GoTaq </td><td> PróMega </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Interno e externo primers aninhados </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligadura </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Vector Fácil </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Competentes células de E.coli </td><td> Zymo Research Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Equipamento </td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C e 90 ° C Calor Blocos </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C e 50 ° C Os tanques de imersão (42 ° C para as transformações) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cadeira de balanço </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Máquina de PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

Epigenética engloba todas hereditárias e modificações reversíveis de cromatina que alter acessibilidade gene e, portanto, são os principais mecanismos de regulação da transcrição do gene 1. Metilação do DNA é uma modificação epigenética, que atua predominantemente como uma marca repressiva. Através da adição covalente de um grupo metilo em citosinas na dinucleótidos CpG, pode recrutar adicionais proteínas repressores e modificações histona para iniciar processos envolvidos na condensação da cromatina e silenciamento de genes 2. Metilação do DNA é essencial para o desenvolvimento normal, pois desempenha um papel fundamental na programação do desenvolvimento, diferenciação celular, a repressão de elementos retrovirais, inativação do cromossomo X e imprinting genômico. Um dos métodos mais poderosos para a análise de metilação de DNA é a mutagénese bissulfito. Bissulfito de sódio é um agente mutagénico DNA que deaminates citosinas em uracilos. Após amplificação por PCR e Seque<html> ncing, estes eventos de conversão são detectados como timinas. Citosinas metiladas são protegidos de desaminação e, assim, permanecer como citosinas, permitindo a identificação de metilação de ADN a nível individual de nucleótidos 3. Desenvolvimento da mutagênese bissulfito avançou daqueles originalmente informados 4-6 para aqueles que são mais sensíveis e reprodutíveis 7. Um avanço chave foi a incorporação de pequenas quantidades de DNA em um grânulo de agarose, protegendo assim o DNA a partir do tratamento com bissulfito dura 8. Esta análise de metilação habilitado a ser realizada em piscinas de oócitos e embriões em estágio de blastocisto 9. O protocolo de mutagênese mais sofisticado bissulfito de data é para cada estágio de blastocisto-embriões 10. No entanto, uma vez que os blastocistos têm, em média 64 células (contendo 120-720 pg de DNA genómico), este método não é eficaz para os estudos de metilação em oócitos individuais ou de clivagem-stage embriões. tenda &quot;&gt; Tomar pistas de agarose incorporação de quantidades de DNA minutos, incluindo oócitos 11, aqui apresentamos um método pelo qual os oócitos são diretamente incorporado em um agarose e solução de lise talão de recuperação imediatamente a seguir e remoção da zona pelúcida do ovócito. Isso nos permite ignorar os dois principais desafios da mutagénese único oócito bissulfito:. protectores uma pequena quantidade de DNA a partir de degradação, e subsequente perda durante os passos do protocolo numerosas importante, como os dados são obtidos a partir de oócitos individuais, a questão da PCR viés dentro piscinas é eliminado Além disso. , a contaminação de células do cumulus inadvertida é detectável por este método uma vez que qualquer amostra com mais do que um padrão de metilação pode ser excluídos da análise 12. Este protocolo fornece um método melhorado para análises de sucesso e reprodutível de metilação do DNA ao nível de uma única célula e é idealmente adequado para oócitos individuais, bem como estágios de clivagem dos embriões.

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Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.

Mutagênese Bissulfito Único de ovócitos

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K visualizações.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. Mutagênese bissulfito é o padrão ouro para a análise de metilação do DNA. Nosso protocolo modificado permite a análise de metilação do DNA ao nível de uma única célula e foi projetado especificamente para oócitos individuais. Também pode ser utilizado para a clivagem do estágio-embriões.

Vídeo: Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagênese do site caseiros Direção de Plasmids Whole

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Biologia

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Uma Introdução ao Lab Worm: de Worms Cultivar a mutagênese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Avaliação do mouse microinjeção de oócitos, maturação e ploidia

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

O<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Cut-aberto vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Com Fluorometria

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Um Protocolo de Avaliação Funcional da Whole-Protein saturação mutagênese Bibliotecas Utilizando-High Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Hidrogéis alginatos desordeiros descabidos proteolíticos e microbiorreatores hidrofóbicos para encapsulamento de oócito suíno

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para a Mutagênese CRISPR/Cas9 da Mosca da Fruta Oriental Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...