Name: corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Kaisa Ikkala por sua inestimável assistência técnica e perspicaz ajuda quando atualizando este método, bem como mais tarde durante a implementação às nossas perguntas de pesquisa central. Também gostaríamos de agradecer sua ajuda com planejamento as orientações do veterinário trabalho o centro de animais de laboratório e Anna Meller.

Todas as experiências são aprovadas pelo Conselho Nacional de experimento animal.
1. preparações
<ol><li>Preparar todas as soluções e manter em temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Siga os regulamentos de eliminação de resíduos para dispose utilizado materiais e soluções.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR consanguíneo ações, entre as idades de 4 a 12 semanas e ambos os sexos. Se usando a linhagem C57BL/6, siga o método de preparação de cetamina-medetomidina na etapa 1.3.2. Para outras etapas, siga as instruções descritas em 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Prepare o medicamento veterinário fresco e no tempo, antes de iniciar a operação. Carprofeno será usado mais tarde, assim não é necessário para prepará-lo neste momento.<ol>
<li>Para preparar uma solução de cetamina-medetomidina para anestesia, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina (Ketaminol Vet) com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor Vet) e adicione 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Para preparar uma solução mais diluída de cetamina-medetomidina anestesia em camundongos C57BL/6, misturar 0,375 mL (concentração de ações 50mg/mL) da cetamina com 0,25 mL (concentração de ações 1 mg/mL) de medetomidina e adicionar 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (3,75 mg/kg, cetamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Este é um passo alternativo, apenas para adultos camundongos C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar o buprenorfin para analgesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administre 0,2 mL/20 g de massa de rato (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar o atipamezole para interromper a anestesia, adicionar 0,1 mL (concentração de ações 5 mg/mL) de atipamezole para 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de massa de rato (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para analgesia durante pós-anestesia use carprofeno. Adicionar 0,1 mL (concentração de ações 50mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0,9% NaCl. Administre 0,15 mL/20 g de peso do rato (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de coloração fluorescente<ol>
<li>Para visualizar a abrasão sob a luz azul cobalto (Figura 1), use uma solução fluorescente. Preparar uma solução de fluoresceína 0,1% primeira medição 10 mg de sal de fluoresceína com uma escala bem e em seguida, adicioná-lo a 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger a solução de fluoresceína de luz e agitar durante 5 minutos em uma coqueteleira. Nota: A solução de fluoresceína é sensível à luz; manter a solução coberta de luz. Esta solução pode ser armazenada em + 4 ° C durante 2-3 dias. Para uso, é útil colocar a solução de fluoresceína em um frasco conta-gotas que é usado para colírio. Use um filtro estéril quando se deslocam a solução para o frasco conta-gotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe a ponta da rebarba ocular antes e após o uso; primeiro com PBS e, em seguida, com 70% EtOH. Se tornando uma abrasão para vários ratos durante a mesma operação, fazer as limpeza etapas entre cada rato.</li>
	<li>Ponha a placa aquecida (37 ° C) e coloque uma toalha de papel nele.</li>
</ol>2. corneal abrasão
Atenção: Utilize protectores (luvas, jaleco) quando lidar com ratos. Pese o mouse para estimar o volume de medicação a administrar.
<ol><li>Use o método agarrando com uma mão para manipular o rato23. Administrar a mistura de cetamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) no abdômen inferior esquerdo. Coloque o mouse para uma gaiola individual e esperar que caia no sono. Isso geralmente leva menos de 5 minutos. Em seguida, administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação. Nota: Uma vez que a anestesia é dada, o protocolo deve não ser pausado a qualquer momento.</li>
	<li>Antes de continuar, verifique se a placa aquecida é quente. Coloque o mouse anestesiado na chapa aquecida. O nível da anestesia é bom se o reflexo de cauda está ausente, mas o reflexo do dedo do pé está presente. Estes reflexos por beliscar a cauda e qualquer dedo do pé com os dedos ou uma pinça. Não use força excessiva. Anestesia vai durar 20-25 minutos.</li>
	<li>Para tornar uma abrasão, use a rebarba ocular limpa. Gire a base das rebarbas para ativar a vibração que é essencial para fazer a abrasão. Senti a vibração na mão, quando a rebarba está funcionando corretamente.<ol>
<li>Abra um olho de cada vez, mantendo as pálpebras separadamente com os dedos. Então firmemente tocar as rebarbas para a córnea e deslocar o instrumento e para trás, bem como para os lados da superfície ocular. A vibração de rebarba executará o zero; Não pressione, agitar ou rasgar a córnea. A córnea central, 20 movimentos na superfície de abrasão são suficientes para induzir a ferida. Não levante a rebarba e tentar ficar na região da córnea para ser desgastados. Adquirir uma abrasão tamanho padrão exigirá várias rodadas de prática.</li>
	</ol>
 Nota: Assepsia da córnea pode ser conseguida antes de abrasão usando betadine solução oftálmica.</li>
</ol>3. imagem latente a abrasão
<ol><li>Ilumine a região abradada usando solução de fluoresceína e luz de caneta azul cobalto (Figura 1). A superfície ocular parece incolor em luz ambiente. Após a aplicação de fluoresceína, região abradada fluoresce a verde quando iluminando o olho com a caneta de luz.<ol>
<li>Se necessário, abra o olho abradado da mesma forma como no 2.3 e administrar uma gota de solução de fluoresceína do frasco conta-gotas. Lavar o olho uma vez com PBS ou 0,9% NaCl para reduzir fundo da fluoresceína. Use um frasco conta-gotas ou uma pipeta para lavagem. Aspirar o líquido fora com uma limpeza suave e limpar os cílios, se necessário. O excesso de líquido geralmente coleta à fronteira nasal do olho, perto da abertura do canal lacrimal. Atenção: Evite tocar a córnea enquanto cleaining como escoriações menores podem ser induzidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fotografa a abrasão da córnea.<ol>
<li>Para obter imagens semelhantes durante cada sessão de imagens, use ferramentas de fixação constante para a luz de caneta azul cobalto e a câmera de SLR (Figura 2). Este protocolo fornece uma configuração fácil de repetir (Figura 2).<ol>
<li>Para anexar a luz caneta e a câmera, use um candeeiro de mesa com um braço flexível e braçadeira e um braço de câmera ajustável com uma pinça, respectivamente. Cabo-tie a caneta de luz ao candeeiro de mesa e posição logo acima do olho do rato. A luz de posicionamento diferente pode alterar a visualização da abrasão. Uma sugestão para o posicionamento dessas ferramentas é descrita na Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Use a câmera SLR para tirar fotos do olho. Coloque o animal em uma distância desejada e a posição e o foco da câmera (01:12) na luz do quarto. Depois disso, feche todas as outras luzes, exceto a luz de caneta azul cobalto. Nota: O manípulo de luz caneta de fita para baixo ou use um elástico para manter a luz acesa o tempo todo durante a imagem latente. Isto pode ajudar se a imagem se torna embaçada. É mais fácil de executar a etapa de imagem com um colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. acordar após abrasão Corneal
<ol><li>Administre buprenorfin primeiro e, em seguida, atipamezole via i.p. injeções. Use a mesma técnica de manipulação, como em 2.1.</li>
	<li>Coloque uma gota de antibacteriano, fucidin ácido pomada (Isathal) para olhos desgastados e não-desgastada para hidratar e manter a superfície ocular limpo de bactérias após a anestesia.</li>
	<li>Como o mouse vai acordar em 5-20 minutos na placa aquecida, observe o mouse durante o período pós-anestésico do despertar. Quando torna-se móvel, coloque-o em uma gaiola individual. Nota: Se acordar leva mais tempo, coloque o rato na gaiola com uma almofada aquecida ou coloque a gaiola inteira sobre a chapa aquecida e monitorar o mouse regularmente. Enquanto o efeito da anestesia, o mouse normalmente sacode e atinge para cima com o corpo anterior. Esse comportamento deve retornar ao normal em 3-4 horas e então você pode colocar o mouse volta para uma jaula compartilhada.</li>
	<li>Administre o carprofeno i.p. para analgesia e olho pomada em dois dias consecutivos após a abrasão, da mesma forma como em passos 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imagem latente durante a cicatrização de feridas
<ol><li>Neste protocolo, tempo de uso aponta 18 h e 72 h após a abrasão para observar o fechamento da ferida.<ol>
<li>Para tratamento de imagens consecutivo, anestesia os ratos como explicado no ponto 2.2.</li>
		<li>Tire fotos como explicado em 3.</li>
		<li>Acorde os animais com atipamezole i.p. e monitorar o período de despertar, conforme explicado no ponto 4.3. Nota: se não continuar o acompanhamento, eutanásia o mouse logo após 5.1.2. Eutanásia é descrita em 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea coleção e incorporação de parafina
<ol><li>Após o último ponto de tempo, sacrifica o animal. Coloque o mouse em uma câmara que pode ser preenchida com CO2. Encher o ar da câmara com CO2. Quando o animal fica imóvel, deslocar as vértebras cervicais puxando firmemente da base da cauda e pressionando a região do pescoço para baixo, ao mesmo tempo. Cuidado: Siga sempre as orientações do órgão local de bem-estar animal.</li>
	<li>Recolha o globo ocular inteiro cortando uma abertura na pele para o lado do olho com uma tesoura de dissecação. Coloque a tesoura sob o globo ocular e cortar o nervo ocular para estalar o globo ocular fora da órbita. Use a pinça se o olho não sai facilmente.<ol>
<li>Faça um buraco na parte de trás do olho, do lado da retina, com uma agulha 26G para permitir a livre penetração das soluções dentro do olho. Nota: Não deixe o olho tornar-se seca, em vez disso, colocá-lo em PBS até continuando com o protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recolha o globo ocular em um tubo de 2 mL com PBS. Não pausa o experimento neste ponto.</li>
	<li>Remover o PBS e corrigir olhos em paraformaldeído 4% (PFA) em + 4 ° C por 4-5 horas.</li>
	<li>Mova o olho fixo para uma fita de tecido para processamento do tecido. Use um tecido de processamento da máquina e o programa a seguir:<ol>
<li>Enxaguar com PBS.</li>
		<li>Incube 2 x 45 min em etanol a 70% à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incube 2 x 1 h em 94% de etanol na temperatura de quarto.</li>
		<li>Incube 3 x 45 min em etanol absoluto à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em xilol, a temperatura e a último xileno a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h em cera de parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após processamento de tecido, incorpore o globo ocular em parafina líquida (+ 60 ° C), usando um bloco de incorporação de tecido. Coloque o olho dentro do bloco é olhar para os lados e a borda periférica é virada para cima. Deixe o bloco solidificar em um prato legal por 5-10 minutos.</li>
</ol>7. parafina seções da córnea
<ol><li>Prepare o micrótomo para corte de acordo com as instruções da instituição ou do fabricante. Cuidado: Tenha cuidado ao manusear a lâmina afiada do micrótomo.</li>
	<li>Banho de água de um lugar com temperatura de água ultrapura ao lado do micrótomo e outro com água ultrapura aquecido a + 50 ° C.</li>
	<li>Fazer 5 µm de espessura seções do globo ocular. Nota: A lente rompe facilmente durante o corte. Para evitar isso, limpe a superfície do corte com um tecido úmido, cada vez que uma nova linha de seções é iniciada. Use água da torneira para umedecer o tecido.</li>
	<li>Colocar as seções ao lado do outro em banho de água a temperatura ambiente e em seguida, movê-los para o banho de água quente com a ajuda de uma lâmina de vidro. Estica o banho de água quente, até que todas as rugas relaxar e o fosco seções tornam-se as seções.</li>
	<li>Secar as lâminas de vidro com seções pernoite em 37 ° C.</li>
	<li>Anexar as seções para os slides, mantendo o slide por 1 minuto em uma placa aquecida em + 60 ° C. Depois disso, as seções podem ser diretamente processadas para coloração, métodos reagidos ou armazenadas em + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Ferindo métodos são ferramentas populares para estudar diferentes aspectos da homeostase da córnea e patologias. O modelo de abrasão oferece um método bem controlado para resolver problemas relevantes em oftalmologia. No entanto, determinados pontos críticos no protocolo são vale a pena enfatizar. Notavelmente, os detalhes descritos em matéria de medicina veterinária, ferida cura cronograma e resultado são otimizados para uso com estoques NMRI e ICR outbreds, mas podem variar entre cepas de ratos<sup class="xre...

Epitelial de inúmeros órgãos está expostos a lesões. No entanto, eles também contêm a capacidade de compensar a perda de tecido através da cicatrização da ferida. A córnea oferece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. Forma a superfície externa do olho e fornece uma camada protetora para a maquinaria ocular sensível. Assim, a córnea funciona como uma barreira física para patógenos e perda de água. É composto de três camadas; epitélio, estroma e endotélio. O epitélio da córnea torna-se a camada mais externa da córnea. Células epiteliais mantêm a função de barreira da córnea aderindo estritamente ao outro através de junções apertadas1,2,3. Uma membrana basal acelular da córnea, membrana de Bowman, separa o epitélio do estroma extensivo, que contém keratocytes refratário. Sob o estroma, células endoteliais canal nutrientes, água e oxigênio para a camada superior.
Abrasões da córnea são muito comuns na clínica4. Lesões de córnea são diversos, mas em grande parte são causados por pequenas partículas, como poeira ou areia, arranhões ou outros objectos estranhos. O protocolo descrito aqui visa reproduzir um tipo clinicamente relevante de abrasão epitelial da córnea. Ao fazê-lo, este protocolo fornece um método controlável e seminal para clínicos e cientistas da córnea implementar em seus próprios estudos. Efetuamos um ensaio de reparo de lesões no vivo na córnea murino por abrasão o tecido com uma rebarba ocular entorpecida, o II Algerbrush. Aqui, temos como alvo a abrasão para o epitélio corneano central e deixar as outras partes do órgão sem danos. Assim, o protocolo é ideal para estudo célula epitelial da córnea dinâmica ou a membrana basal durante a re-epitelização, célula de migração, proliferação e diferenciação em vivo5. Recentemente, este modelo foi usado para analisar a dinâmica de células progenitoras na córnea murino, bem como para desvendar a capacidade das células epiteliais da córnea diferenciadas em re-estabelecer o nicho de células-tronco da córnea após lesão6,7. Após abrasão, a córnea retorna ao seu normal transparência e resistência à tração. Curiosamente, um estudo em vitro indicou que re-epitelização ocorre sem célula maior proliferação8. Este protocolo descreve a linha do tempo de cicatrização ininterrupta na córnea murino. O método é, portanto, aplicável para testar o efeito das drogas sobre a cura de padrões e velocidade.
A córnea tem sido extensivamente usada para estudos de cicatrização de feridas. No entanto, muitos estudos têm contado com outros modelos de lesão. Um modelo bem estabelecido de lesão da córnea é a queimadura alcalina é executada através da aplicação de hidróxido de sódio (NaOH) com ou sem papel de filtro sobre a superfície da córnea9. Alcalina exposição resulta em uma lesão grande e difusa que afeta não só o epitélio corneano, mas também a conjuntiva e estroma9,10. Soluções alcalinas fortes foram mostradas para induzir úlceras da córnea, opacificação e neovascularização9. Células inflamatórias invadem o estroma geralmente dentro de 6 h e permanecem lá até 24 h11. Assim, a lesão alcalina é um método aconselhável em estudos relacionados à ativação do estroma. Um outro tipo de lesão química pode ser infligido aplicando dimetilsulfóxido (DMSO) na córnea9,10. Outros modelos de lesões comumente usados incluem feridas incisional que penetram através do estroma e fotorrefrativa feridas, que são limitadas a porção superior do estroma14,15. Esses métodos também são úteis para responder perguntas sobre a cicatrização de feridas do estroma. Lesão de diferentes modelos têm suas próprias vantagens e desvantagens. Abrasão, ou desbridamento, do epitélio corneano foi desenvolvida usando bisturis entorpecidas ou lâminas em ex vivo córneas16. Este método foi mais tarde usado na vivo no rato, rato e coelho17,18,19,20,21,22. Usando a rebarba ocular (Figura 1), removemos apenas uma região selecionada do epitélio, deixando o resto do epitélio afetado. Desta forma, é possível segmentar com precisão a remoção epitelial para diferentes partes do cornea. Além disso, o tamanho de abrasão pode ser avaliado com coloração de fluoresceína. Além disso, aqui seguimos encerramento abrasão durante o período de cicatrização.
Esse método apresenta diversas vantagens, i) incluindo a localização precisa do local de abrasão, que não é possível com lesão química, ii) a abrasão é rápida a executar e iii) é não-invasivo. Aqui, descrevemos o método usando o mouse NMRI outbred como modelo, no entanto, isso poderia ser aplicado para a vasta gama de modelos genéticos de rato, bem como para o rato e o coelho, que são modelos comuns usados para estudar a ruptura da córnea humana.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>use sterile</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Market name: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Market name: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Market name: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Market name: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Market name: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Market name: Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline solution</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Blue pen light</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digital SLR camera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable camera arm and clamp</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Height 28 cm</td></tr><tr><td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection toolset</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue casette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing machine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

A córnea murino fornece um excelente modelo para estudar a cicatrização de feridas. A córnea é a camada mais externa do olho e, portanto, é a primeira defesa de lesão. Na verdade, o tipo mais comum de lesão ocular encontrado na clínica é uma abrasão da córnea. Aqui, nós utilizamos uma rebarba ocular para induzir uma abrasão, resultando na remoção do epitélio corneano na vivo em ratos anestesiados. Este método permite a interrupção epitelial visada e reprodutível, deixando outras áreas intactas. Além disso, descrevemos a visualização do epitélio com fluoresceína mancha abradado e fornecer aconselhamento concreto sobre como visualizar a abrasão da córnea. Então, seguimos a linha do tempo da ferida cura 0, 18 e 72 h após a abrasão, até que a ferida é re-epithelialized. O modelo de abrasão epitelial de lesão corneana é ideal para estudos sobre a proliferação de células epiteliais, migração e re-epitelização das camadas da córnea. No entanto, esse método não é ideal para estudar a ativação do estroma durante a cicatrização de feridas, porque a rebarba ocular não penetra nas camadas de células do estroma. Esse método também é apropriado para aplicações clínicas, por exemplo, pré-clínicos teste de eficácia de drogas.

Este protocolo descreve um modelo para infligir um dano de abrasão ao cornea de rato e sugere como seguir e visualizar o processo de cicatrização após a abrasão. Recentemente, utilizamos este método para estudar o papel das células progenitoras epiteliais da córnea durante6de cicatrização de feridas. O uso de ferramentas estabelecidas é a chave para uma experiência bem sucedida de abrasão. Nós e outros, têm usado as rebarbas ocular Algerbrush II (<st...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K visualizações.  University of Helsinki. Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

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Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Biologia do Desenvolvimento

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of transparency due to fibrotic scarring. The tissue integrity of injured embryonic corneas is intrinsically restored with no detectable scar formation. Given its accessibility and ease of manipulation, the chick embryo is an ideal model for studying scarless corneal wound repair. This protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. First, eggs are windowed at early embryonic ages to access the eye. Second, a series of in ovo physical manipulations to the extraembryonic membranes are conducted to ensure access to the eye is maintained through later stages of development, corresponding to when the three cellular layers of the cornea are formed. Third, linear cornea wounds that penetrate the outer epithelial layer and the anterior stroma are made using a microsurgical knife. The regeneration process or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure. Studies to date using this model have revealed that wounded embryonic corneas display activation of keratocyte differentiation, undergo coordinated remodeling of ECM proteins to their native three-dimensional macrostructure, and become adequately re-innervated by corneal sensory nerves. In the future, the potential impact of endogenous or exogenous factors on the regenerative process could be analyzed in healing corneas by using developmental biology techniques, such as tissue grafting, electroporation, retroviral infection, or bead implantation. The current strategy identifies the embryonic chick as a crucial experimental paradigm for elucidating the molecular and cellular factors coordinating scarless corneal wound healing.

The present protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. The regenerating or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure.&#160;

Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with conjunctiva. Patients suffer from recurrent corneal defects, pain, inflammation, and loss of vision.
Previously, a murine model of LSCD was described and compared to two other models. The goal was to produce a consistent mouse model of LSCD that both mimics the phenotype in humans and lasts long enough to make it possible to study the disease pathophysiology and to evaluate new treatments. Here, the technique is described in more detail.
A motorized tool with a rotating burr has been designed to remove the rust rings from the corneal surface or to smooth the pterygium bed in patients. It is a suitable device to create the desired LSCD model. It is a readily available, easy-to-use tool with a fine tip that makes it appropriate for working on small eyes, as in mice. Its application prevents unnecessary trauma to the eye and it does not result in unwanted injuries, as often is the case with chemical injury models. As opposed to a blunt scraper, it removes the epithelium with the basement membrane. In this protocol, the limbal area was abraded two times, and then the whole corneal epithelium was shaved from limbus to limbus. To avoid stroma injury, care was taken not to brush the corneal surface once the epithelium was already removed.

The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Medicina

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

Protocolos de danos às fibras sensoriais da córnea para estudos de regeneração de axônios

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de inervação da córnea por meio de modelos inovadores 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Neurociência

Mongolian Gerbils as an Animal Model of Wound Healing

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving patients' eye health. Historically, corneal healing has been studied in rodents such as mice and rats, but these models might not completely mimic human disorders. However, information on other rodents such as Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) is scant in corneal research.
Here, we describe a technique to develop a novel animal model for studying corneal healing after photorefractive keratectomy. Due to the limited literature available on the cornea of M. unguiculatus, we also describe a histological analysis of the normal cornea. These research techniques can also be employed in the study of eye diseases because of the similarity between the corneas of Mongolian gerbils and humans in terms of genetics, anatomy, and physiology.

This article describes a new animal model developed to study the anatomy and histology of the cornea and its healing processes. This new animal model uses the Mongolian gerbil, which has a cornea with many similarities to the human cornea.

Gerbils mongóis como um modelo animal de cicatrização de feridas

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving ...

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Resumo

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Estabelecimento de um clinicamente relevantes

Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Três estratégias para induzir ceratite neurotrófica e regeneração nervosa na córnea murina

Gerbils mongóis como um modelo animal de cicatrização de feridas