Name: corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Vorremmo ringraziare Kaisa Ikkala per la sua preziosa assistenza tecnica e aiuto perspicace quando sta attuando questo metodo e anche più tardi durante l'attuazione alle nostre domande di ricerca centrale. Vorremmo anche ringraziare il laboratorio Animal Center e Anna Meller per aiutarla con le linee guida del lavoro veterinario di pianificazione.

Tutti gli esperimenti sono approvati dal Consiglio nazionale esperimento sugli animali.
1. preparati
<ol><li>Tutte le soluzioni di preparare e tenere a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. Seguire le normative sullo smaltimento dei rifiuti per dispose utilizzato materiali e soluzioni.</li>
	<li>Uso NMRI e ICR esogami scorte, fra 4-12 settimane di età e di entrambi i sessi. Se si utilizza il ceppo C57BL/6, seguire il metodo di preparazione di ketamina-medetomidina nel passaggio 1.3.2. Per altre fasi, seguire le istruzioni descritte in 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparare la medicina veterinaria fresco e in tempo prima di iniziare l'operazione. Carprofen verrà utilizzato in seguito, quindi non è necessario prepararlo a questo punto.<ol>
<li>Per preparare una soluzione di ketamina-medetomidina per anestesia, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina (Ketaminol Vet) con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina (Cepetor Vet) e aggiungere 1,25 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg, ketamina e 1 mg/kg, medetomidina).</li>
		<li>Per preparare una soluzione più diluita di ketamina-medetomidina per anestesia su topi C57BL/6, mescolare 0,375 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di ketamina con 0,25 mL (concentrazione di riserva 1 mg/mL) di medetomidina e aggiungere 2,5 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (3,75 mg/kg, ketamina e 0,5 mg/kg, medetomidina). Nota: Questo è un passo alternativo, solo per topi C57BL/6 adulti.</li>
		<li>Per preparare buprenorfin per analgesia, aggiungere 0,1 mL (stock concentrazione 0,3 mg/mL) di buprenorfin a 1,9 mL di sterile 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse di 0,2 mL/20 g (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Per preparare atipamezolo interrompendo l'anestesia, aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 5 mg/mL) di atipamezolo a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare il peso del mouse 0,15 mL/20 g (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Per analgesia durante la post-anestesia utilizzare carprofen. Aggiungere 0,1 mL (concentrazione di riserva 50 mg/mL) di carprofen a 4,9 mL dello 0,9% NaCl. Amministrare 0,15 mL/20 g di peso del mouse (7,5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare soluzione colorante fluorescente<ol>
<li>Per visualizzare l'abrasione sotto la luce blu cobalto (Figura 1), utilizzare una soluzione fluorescente. Preparare una soluzione di fluorescina di 0,1% di prima misura 10 mg di sale della fluorescina con una scala fine e quindi aggiungerlo a 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteggere la soluzione di fluorescina da luce e agitare per 5 minuti su un agitatore. Nota: La soluzione di fluorescina è sensibile alla luce; mantenere la soluzione coperta dalla luce. Questa soluzione può essere conservata a + 4 ° C per 2-3 giorni. Per l'uso, è utile posizionare la soluzione della fluorescina in una bottiglia contagocce che viene utilizzata per collirio. Utilizzare un filtro sterile-quando si sposta la soluzione per il flacone con contagocce.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire la punta di burr oculare prima e dopo l'uso; prima con PBS e poi con 70% EtOH. Se effettua un'abrasione ai topi diversi durante la stessa operazione, eseguire le fasi di pulizia tra ogni mouse.</li>
	<li>Mettere la piastra riscaldata su (+ 37 ° C) e posizionare un asciugamano di carta su di esso.</li>
</ol>2. corneale abrasione
Attenzione: Utilizzare abiti protettivi (guanti, camice da laboratorio) quando movimentazione topi. Pesare il mouse per stimare il volume di farmaco da somministrare.
<ol><li>Utilizzare il metodo scruffing con una sola mano per gestire il mouse23. Somministrare la miscela di ketamina-medetomidina intraperitonealmente (i.p.) all'addome inferiore sinistra. Posizionare il mouse a una gabbia individuale e aspettare che si addormenti. Questo richiede in genere meno di 5 minuti. Quindi, amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione. Nota: Una volta che l'anestesia è dato, il protocollo non dovrebbe essere sospesa in qualsiasi momento.</li>
	<li>Prima di continuare, verificare che la piastra sia calda. Posizionare il mouse anestetizzato sulla piastra riscaldata. Il livello di anestesia è buono se il riflesso di coda è assente, ma il riflesso di punta è presente. Controllare questi riflessi pizzicando la coda e qualsiasi punta con le dita o pinze. Non applicare una forza eccessiva. L'anestesia sarà di 20-25 minuti.</li>
	<li>Per rendere un'abrasione, utilizzare la bava oculare pulita. Ruotare la base della bava per attivare la vibrazione che è essenziale per rendere l'abrasione. Sentite la vibrazione in mano, quando la bava sta funzionando correttamente.<ol>
<li>Aprire un occhio alla volta tenendo le palpebre separatamente con le dita. Quindi saldamente toccare la bava alla cornea e muoversi avanti e indietro anche lo strumento come lateralmente sulla superficie oculare. La vibrazione della bava si esibirà il gratta e Vinci; non premere, scuotere o strappare la cornea. Nella cornea centrale, 20 movimenti sulla superficie di abrasione sono sufficienti per indurre la ferita. Non sollevare la bava e cercare di rimanere nella regione di cornea per essere abrasa. L'acquisizione di un'abrasione dimensioni standard richiederà diversi giri di pratica.</li>
	</ol>
 Nota: Asepsi corneale possono essere ottenuto prima all'abrasione utilizzando betadine soluzione oftalmica.</li>
</ol>3. l'abrasione di imaging
<ol><li>Illuminare l'area abrasa utilizzando blu cobalto penna luce (Figura 1) e soluzione di fluorescina. La superficie oculare appare incolore in luce ambiente. Dopo l'applicazione della fluorescina, regione abrasa reagisce in verde quando illuminando l'occhio con la penna luminosa.<ol>
<li>Se necessario, aprire l'occhio abrasa similmente come 2.3 e amministrare una goccia della soluzione di fluorescina dal flacone con contagocce. Lavare l'occhio una volta con PBS o 0,9% NaCl per ridurre di fondo della fluoresceina. Utilizzare un contagocce o una pipetta per il lavaggio. Aspirare il liquido via con un panno morbido e pulire le ciglia, se necessario. Il liquido in eccesso si raccoglie solitamente al bordo nasale dell'occhio, vicino all'apertura del canale lacrima. Attenzione: Evitare di toccare la cornea mentre cleaining abrasioni minori potrebbero essere indotti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scattare foto dell'abrasione cornea.<ol>
<li>Per ottenere immagini simili durante ogni sessione di imaging, è possibile utilizzare strumenti di attacco costante per la luce di penna blu cobalto e la fotocamera reflex (Figura 2). Questo protocollo fornisce un programma di installazione che è facile da ripetere (Figura 2).<ol>
<li>Per collegare la penna illuminante e la fotocamera, utilizzare una lampada da tavolo con un braccio flessibile e morsetto e braccio regolabile per una telecamera con un morsetto, rispettivamente. Fascetta di penna ottica per la lampada da tavolo e la posizione appena sopra l'occhio del mouse. Posizionamento la luce in modo diverso potrebbe alterare la visualizzazione dell'abrasione. Un suggerimento per il posizionamento di questi strumenti è descritto nella Figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare la fotocamera reflex per scattare foto dell'occhio. Metti l'animale in una distanza desiderata e la posizione e la messa a fuoco della fotocamera (01:12) in luce ambiente. Dopo di che, chiudere tutte le altre luci tranne la luce di penna blu cobalto. Nota: L'impugnatura della penna luce del nastro verso il basso o utilizzare un elastico per tenere la luce accesa tutto il tempo durante la formazione immagine. Questo potrebbe aiutare se l'immagine diventa sfocata. È più semplice di eseguire il passaggio di imaging con un collega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. svegliarsi dopo abrasione corneale
<ol><li>Amministrare buprenorfin prima e poi atipamezolo via i.p. iniezioni. Utilizzare la stessa tecnica di movimentazione come in 2.1.</li>
	<li>Mettere una goccia di unguento acido occhio fucidin antibatterico, (Isathal) agli occhi sia abrasi e non-raspato per idratare e mantenere la superficie oculare pulito da batteri dopo l'anestesia.</li>
	<li>Come il mouse si sveglierà in 5-20 minuti sulla piastra riscaldata, osservare il mouse durante il periodo di risveglio post-anestetico. Quando diventa mobile, posto in una gabbia individuale. Nota: Se svegliarsi richiede più tempo, posizionare il mouse nella gabbia con un pad riscaldato o collocare l'intera gabbia sulla piastra riscaldata e monitorare regolarmente il mouse. Mentre l'anestesia svanisce, il mouse in genere scuote e raggiunge verso l'alto con il corpo anteriore. Questo comportamento dovrebbe tornare alla normalità in 3-4 ore e quindi è possibile inserire il mouse indietro per una gabbia condivisa.</li>
	<li>Amministrare il carprofen i.p. per analgesia e occhio unguento per due giorni consecutivi dopo l'abrasione, similmente come in passaggi 2.2. e 4.2.</li>
</ol>5. imaging durante la guarigione della ferita
<ol><li>In questo protocollo, tempo di utilizzo punti 18 e 72 h dopo abrasione ad osservare la chiusura della ferita.<ol>
<li>Per l'imaging consecutivi, anestetizzare i topi come spiegato al punto 2.2.</li>
		<li>Scattare foto come spiegato in 3.</li>
		<li>Sveglia gli animali con atipamezolo i.p. e monitorare il periodo di risveglio, come spiegato al punto 4.3. Nota: se non continuando il follow-up, eutanasia il mouse subito dopo 5.1.2. L'eutanasia è descritto in 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cornea insieme e inclusione in paraffina
<ol><li>Dopo l'ultimo punto di tempo, il sacrificio dell'animale. Posizionare il mouse in una camera che può essere riempita con CO2. Riempiono l'aria di camera di CO2. Quando l'animale è immobile, slogare vertebre cervicali tirando con forza dalla base della coda e premendo la regione del collo verso il basso allo stesso tempo. Attenzione: Seguire sempre le linee guida del corpo locale benessere degli animali.</li>
	<li>Raccogliere l'intero bulbo oculare dal taglio di un'apertura nella pelle al lato dell'occhio con le forbici di dissezione. Mettere le forbici sotto il bulbo oculare e tagliare il nervo oculare per far comparire il bulbo oculare fuori orbita. Utilizzare pinze se l'occhio non esce facilmente.<ol>
<li>Fare un foro sulla parte posteriore dell'occhio, sul lato della retina, con un ago da 26G per consentire la penetrazione gratuito delle soluzioni all'interno dell'occhio. Nota: Non lasciare che l'occhio diventa secca, invece, posto in PBS fino continuando con il protocollo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere il bulbo oculare in una provetta da 2 mL con PBS. Non mettere in pausa l'esperimento a questo punto.</li>
	<li>Rimuovere PBS e difficoltà bulbi oculari in paraformaldeide al 4% (PFA) a + 4 ° C per 4-5 ore.</li>
	<li>Spostare il bulbo oculare fisso su una videocassetta di tessuto per l'elaborazione del tessuto. Utilizzare un tessuto lavorazione macchina e il seguente programma:<ol>
<li>Risciacquare con PBS.</li>
		<li>Incubare 2 x 45 min in etanolo al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 2 x 1 h in etanolo al 94% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 45 min in etanolo assoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in xilene, a temperatura ambiente e ultimo xilene a 37 ° C.</li>
		<li>Incubare 3 x 1 h in cera di paraffina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo la lavorazione del tessuto, incorporare il bulbo oculare in paraffina liquida (+ 60 ° C) utilizzando un blocco di incorporamento del tessuto. Posto l'occhio all'interno del blocco in modo che esso sta osservando obliquamente e il bordo periferico è rivolto verso l'alto. Lasciate che il blocco solidificare su una piastra fredda per 5-10 minuti.</li>
</ol>7. paraffina sezioni della Cornea
<ol><li>Preparare il microtomo per il sezionamento secondo le istruzioni dell'istituzione o del produttore. Attenzione: Fare attenzione a maneggiare la lama tagliente del microtomo.</li>
	<li>Posto un bagnomaria con acqua ultrapura a temperatura ambiente al lato del microtomo e l'altra con acqua ultrapura riscaldata a + 50 ° C.</li>
	<li>Fare 5 µm spessore sezioni del bulbo oculare. Nota: La lente si rompe facilmente durante il sezionamento. Per evitare questo, pulire la superficie di taglio con un tessuto umido ogni volta che viene avviata una nuova fila di sezioni. Usare acqua di rubinetto per inumidire il tessuto.</li>
	<li>Inserire le sezioni accanto a altro nel bagno d'acqua temperatura ambiente e quindi spostarli la vasca di acqua calda con l'aiuto di un vetrino. Allungare le sezioni nel bagno acqua calda fino a quando tutte le pieghe e rilassarsi e il mascherino sezioni diventano.</li>
	<li>Asciugare i vetrini con le sezioni durante la notte a + 37 ° C.</li>
	<li>Collegare le sezioni per le diapositive tenendo il vetrino per 1 minuto su un piatto riscaldato a + 60 ° C. Dopo questo, le sezioni possono essere direttamente trattate per immunohistological metodi di colorazione, o conservate a + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yi, X., Wang, Y., Yu, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+tight+junctions+and+their+response+to+lipopolysaccharide+challenge.">Corneal epithelial tight junctions and their response to lipopolysaccharide challenge.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (13), 4093-4100 (2000).</li><li>Wang, Y., Chen, M., Wolosin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO-1+In+Corneal+Epithelium;+Stratal+Distribution+and+Synthesis+Induction+by+Outer+Cell+Removal.">ZO-1 In Corneal Epithelium; Stratal Distribution and Synthesis Induction by Outer Cell Removal.</a> Experimental Eye Research. 57 (3), 283-292 (1993).</li><li>Sugrue, S. P., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZO1+in+Corneal+Epithelium:+Association+to+the+Zonula+Occludens+and+Adherens+Junctions.">ZO1 in Corneal Epithelium: Association to the Zonula Occludens and Adherens Junctions.</a> Experimental Eye Research. 64 (1), 11-20 (1997).</li><li>Jackson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+eye-pads+on+healing+of+simple+corneal+abrasions.">Effect of eye-pads on healing of simple corneal abrasions.</a> British Medical Journal. 2 (5200), 713 (1960).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).</li><li>Kalha, S., Shrestha, B., Sanz Navarro, M., Jones, K. B., Klein, O. D., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++Progenitor+Cell+Dynamics+in+Murine+Cornea+During+Homeostasis+and+Wound+Healing.">Bmi1+ Progenitor Cell Dynamics in Murine Cornea During Homeostasis and Wound Healing.</a> Stem Cells. , (2018).</li><li>Nasser, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal-Committed+Cells+Restore+the+Stem+Cell+Pool+and+Tissue+Boundary+following+Injury.">Corneal-Committed Cells Restore the Stem Cell Pool and Tissue Boundary following Injury.</a> Cell Reports. 22 (2), 323-331 (2018).</li><li>Kaplan, N., Fatima, A., Peng, H., Bryar, P. J., Lavker, R. M., Getsios, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA2/Ephrin-A1+Signaling+Complexes+Restrict+Corneal+Epithelial+Cell+Migration.">EphA2/Ephrin-A1 Signaling Complexes Restrict Corneal Epithelial Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (2), 936 (2012).</li><li>Bai, J. -. Q., Qin, H. -. F., Zhao, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+on+mouse+model+of+grade+II+corneal+alkali+burn.">Research on mouse model of grade II corneal alkali burn.</a> International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).</li><li>Chan, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+matrix+metalloproteinase-12+following+corneal+injury.">Protective effects of matrix metalloproteinase-12 following corneal injury.</a> Journal of Cell Science. 126, 3948-3960 (2013).</li><li>Byeseda, S. E., Burns, A. R., Dieffenbaugher, S., Rumbaut, R. E., Smith, C. W., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+is+necessary+for+epithelial+recruitment+of+gammadelta+T+cells+and+efficient+corneal+wound+healing.">ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of gammadelta T cells and efficient corneal wound healing.</a> American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).</li><li>Amitai-Lange, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+for+Lineage+Tracing+of+Corneal+Cells+Using+Multi-color+Fluorescent+Reporter+Mice.">A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53370 (2015).</li><li>Amitai-Lange, A., Altshuler, A., Bubley, J., Dbayat, N., Tiosano, B., Shalom-Feuerstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Tracing+of+Stem+and+Progenitor+Cells+of+the+Murine+Corneal+Epithelium.">Lineage Tracing of Stem and Progenitor Cells of the Murine Corneal Epithelium.</a> Stem Cells. 33 (1), 230-239 (2015).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;V&#946;6+Integrin+Promotes+Corneal+Wound+Healing.">&#945;V&#946;6 Integrin Promotes Corneal Wound Healing.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52 (11), 8505 (2011).</li><li>Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Thrombospondin-1+in+Repair+of+Penetrating+Corneal+Wounds.">Role of Thrombospondin-1 in Repair of Penetrating Corneal Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (9), 6262 (2013).</li><li>Gipson, I. K., Kiorpes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+sheet+movement:+Protein+and+glycoprotein+synthesis.">Epithelial sheet movement: Protein and glycoprotein synthesis.</a> Developmental Biology. 92 (1), 259-262 (1982).</li><li>Danjo, Y., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+&amp;#34;purse+string&amp;#34;+filaments+are+anchored+by+E-cadherin-mediated+adherens+junctions+at+the+leading+edge+of+the+epithelial+wound,+providing+coordinated+cell+movement.">Actin &amp;#34;purse string&amp;#34; filaments are anchored by E-cadherin-mediated adherens junctions at the leading edge of the epithelial wound, providing coordinated cell movement.</a> Journal of Cell Science. 111, 3323-3332 (1998).</li><li>Lyu, J., Joo, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt-7a+up-regulates+matrix+metalloproteinase-12+expression+and+promotes+cell+proliferation+in+corneal+epithelial+cells+during+wound+healing.">Wnt-7a up-regulates matrix metalloproteinase-12 expression and promotes cell proliferation in corneal epithelial cells during wound healing.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21653-21660 (2005).</li><li>Nagata, M., Nakamura, T., Hata, Y., Yamaguchi, S., Kaku, T., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBP485+promotes+corneal+epithelial+wound+healing.">JBP485 promotes corneal epithelial wound healing.</a> Science Reports. 5, 14776 (2015).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L., Cranfill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+beta+4+integrin+expression+and+localization+in+vivo+in+response+to+corneal+epithelial+injury.">Changes in beta 4 integrin expression and localization in vivo in response to corneal epithelial injury.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 37 (8), 1593-1601 (1996).</li><li>Stepp, M. A., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+alpha+9+integrin+and+tenascin+during+epithelial+regeneration+after+debridement+in+the+cornea.">Upregulation of alpha 9 integrin and tenascin during epithelial regeneration after debridement in the cornea.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 45 (2), 189-201 (1997).</li><li>Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Metodi di ferimento sono popolari strumenti per studiare diversi aspetti dell'omeostasi cornea e patologie. Il modello di abrasione offre un metodo ben controllato per risolvere problemi rilevanti in Oftalmologia. Tuttavia, alcuni punti critici nel protocollo sono la pena sottolineare. In particolare, i dettagli descritti per quanto riguarda la medicina veterinaria, timeline di guarigione della ferita ed il risultato sono ottimizzati per l'uso con le scorte nazionali di NMRI e ICR, ma possono variare tra i ceppi di topi<...

Strati epiteliali di numerosi organi sono esposti alle lesioni. Tuttavia, essi contengono anche la capacità di compensare la perdita di tessuto attraverso la guarigione della ferita. La cornea offre un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. Forma la superficie esterna dell'occhio e fornisce uno strato protettivo per il macchinario di oculare sensibile. In tal modo, cornea funziona come una barriera fisica per gli agenti patogeni e perdita di acqua. Si compone di tre strati; epitelio, stroma ed endotelio. L'epitelio della cornea costituisce lo strato più esterno della cornea. Cellule epiteliali mantengono la funzione di barriera della cornea aderendo strettamente tra loro attraverso giunzioni strette1,2,3. Una acellular della membrana dello scantinato cornea, membrana di Bowman, separa l'epitelio dallo stroma esteso, che contiene keratocytes refrattario. Sotto lo stroma, cellule endoteliali canale nutrienti, acqua e ossigeno allo strato superiore.
Abrasioni corneali sono molto comuni in clinica4. Lesioni alla cornea sono diverse, ma in gran parte sono causate da particelle piccole come polvere o sabbia, graffi o altri corpi estranei. Il protocollo qui descritto mira a riprodurre un tipo clinicamente rilevante di abrasione corneale epiteliale. In tal modo, questo protocollo fornisce un metodo controllabile e seminale per i medici e gli scienziati corneali implementare i propri studi. Abbiamo eseguito un test di riparazione del pregiudizio in vivo sulla cornea Murina da abrasione del tessuto con una bava oculare offuscato, il Algerbrush II. Qui, ci rivolgiamo l'abrasione solo all'epitelio cornea centrale e lasciare le altre parti dell'organo senza danni. Così, il protocollo è ideale per studio delle cellule epiteliali corneali dynamics o la membrana dello scantinato durante riepitelizzazione, cell migrazione, proliferazione e differenziamento in vivo5. Recentemente, questo modello è stato utilizzato per analizzare le dinamiche di cellule progenitrici nella cornea murina pure quanto a svelare la capacità delle cellule epiteliali corneale differenziate nel ristabilire la nicchia delle cellule staminali corneali dopo lesioni6,7. Dopo abrasione, la cornea torna alla sua normale trasparenza e resistenza alla trazione. Interessante, uno studio in vitro hanno indicato che riepitelizzazione avviene senza cellula aumentata proliferazione8. Questo protocollo descrive la sequenza temporale di guarigione senza interruzioni nella cornea murina. Il metodo è così applicabile per testare l'effetto delle droghe sulla guarigione modelli e velocità.
La cornea è stato ampiamente utilizzata per studi di cicatrizzazione. Tuttavia, molti studi hanno fatto affidamento su altri modelli della ferita. Un modello ben consolidato della lesione corneale è l'ustione alcalina che viene eseguita mediante l'applicazione di idrossido di sodio (NaOH) con o senza filtro di carta sulla superficie corneale9. L'esposizione alcalina provoca una ferita grande e diffusa che colpisce non solo l'epitelio corneale, ma anche la congiuntiva e lo stroma9,10. Soluzioni fortemente alcaline hanno dimostrati di indurre ulcere corneali, opacification e neovascolarizzazione9. Cellule infiammatorie invadono lo stroma in genere entro 6 ore e vi rimangono fino a 24 h11. Così, la ferita alcalina è un metodo consigliabile negli studi relazionati all'attivazione stromal. Un altro tipo di ferita chimica può essere inflitto applicando solfossido dimetilico (DMSO) sulla cornea9,10. Altri modelli di lesione comunemente usati includono ferite incisionale che penetrano attraverso le ferite keratectomy e stroma, che sono limitate alla parte superiore del stroma14,15. Questi metodi sono anche utili per rispondere a domande riguardanti la guarigione della ferita stromal. Modelli di diverse lesioni hanno i loro vantaggi e svantaggi. Abrasione o sbrigliamento, dell'epitelio corneale è stato sviluppato utilizzando offuscati bisturi o lame su ex vivo cornee16. Questo metodo è stato successivamente utilizzato in vivo sul topo, ratto e coniglio17,18,19,20,21,22. Utilizzando la bava oculare (Figura 1), togliamo solo un'area selezionata dell'epitelio, lasciando inalterato il resto dell'epitelio. In questo modo, è possibile indirizzare con precisione la rimozione epiteliale in diverse parti della cornea. Inoltre, la dimensione di abrasione è valutabile con la macchiatura della fluorescina. Inoltre, qui seguiamo chiusura abrasione durante il periodo di guarigione.
Questo metodo presenta diversi vantaggi, i) tra cui precisa posizione del sito di abrasione, che non è possibile con ferita chimica, ii) l'abrasione è veloce da eseguire, e iii) è non invasivo. Qui, descriviamo il metodo utilizzando il mouse NMRI nazionali come un modello, tuttavia questo potrebbe essere applicato per la vasta gamma di modelli genetici murini, così come per il ratto e coniglio, che sono comuni modelli usati per studiare la rottura cornea umana.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>use sterile</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Market name: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Market name: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Market name: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Market name: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Market name: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Market name: Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline solution</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Blue pen light</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digital SLR camera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable camera arm and clamp</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Height 28 cm</td></tr><tr><td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection toolset</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue casette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing machine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

La cornea murina fornisce un eccellente modello per studiare la guarigione della ferita. La cornea è lo strato più esterno dell'occhio e così è la prima difesa per infortunio. Infatti, il tipo più comune di lesioni oculari trovati nella clinica è un'abrasione cornea. Qui, utilizziamo un oculare burr per indurre un'abrasione conseguente rimozione dello epitelio corneale in vivo sui topi anestetizzati. Questo metodo consente per rottura epiteliale mirata e riproducibile, lasciando altre aree intatte. In più, descriviamo la visualizzazione dell'epitelio abrasa con la macchiatura della fluorescina e fornire consigli concreti su come visualizzare la cornea abrasa. Quindi, seguiamo la linea temporale di guarigione delle ferite 0, 18 e 72 h dopo abrasione, fino a quando la ferita è re-epithelialized. Il modello di abrasione epiteliale della lesione corneale è ideale per gli studi sulla riepitelizzazione degli strati corneali, la migrazione e la proliferazione delle cellule epiteliali. Tuttavia, questo metodo non è ottimo per studiare l'attivazione stromal durante la guarigione delle ferite, perché la bava oculare non penetrano negli strati di cellule stromali. Questo metodo è anche adatto per applicazioni cliniche, ad esempio, i test pre-clinici di efficacia del farmaco.

Questo protocollo descrive un modello per infliggere un danno all'abrasione alla cornea del mouse e suggerisce come seguire e visualizzare il processo di guarigione dopo abrasione. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare il ruolo delle cellule progenitrici epiteliali corneali durante6di cicatrizzazione. L'uso di strumenti consolidati è la chiave per un esperimento di successo all'abrasione. Noi ed altri, abbiamo utilizzato la bava oculare di Algerbr...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Views.  University of Helsinki. Questo protocollo descrive un metodo per infliggere un'abrasione sulla superficie oculare del mouse e a seguire da allora in poi il processo di cicatrizzazione. Il protocollo si avvale di un oculare burr parzialmente rimuovere l'epitelio di superficie dell'occhio nei topi anestetizzati.

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Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Istituzione di un clinicamente rilevanti<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock chirurgia della cataratta modello per indagare epiteliale Wound Repair in un microambiente Native

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of transparency due to fibrotic scarring. The tissue integrity of injured embryonic corneas is intrinsically restored with no detectable scar formation. Given its accessibility and ease of manipulation, the chick embryo is an ideal model for studying scarless corneal wound repair. This protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. First, eggs are windowed at early embryonic ages to access the eye. Second, a series of in ovo physical manipulations to the extraembryonic membranes are conducted to ensure access to the eye is maintained through later stages of development, corresponding to when the three cellular layers of the cornea are formed. Third, linear cornea wounds that penetrate the outer epithelial layer and the anterior stroma are made using a microsurgical knife. The regeneration process or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure. Studies to date using this model have revealed that wounded embryonic corneas display activation of keratocyte differentiation, undergo coordinated remodeling of ECM proteins to their native three-dimensional macrostructure, and become adequately re-innervated by corneal sensory nerves. In the future, the potential impact of endogenous or exogenous factors on the regenerative process could be analyzed in healing corneas by using developmental biology techniques, such as tissue grafting, electroporation, retroviral infection, or bead implantation. The current strategy identifies the embryonic chick as a crucial experimental paradigm for elucidating the molecular and cellular factors coordinating scarless corneal wound healing.

The present protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. The regenerating or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure.&#160;

Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with conjunctiva. Patients suffer from recurrent corneal defects, pain, inflammation, and loss of vision.
Previously, a murine model of LSCD was described and compared to two other models. The goal was to produce a consistent mouse model of LSCD that both mimics the phenotype in humans and lasts long enough to make it possible to study the disease pathophysiology and to evaluate new treatments. Here, the technique is described in more detail.
A motorized tool with a rotating burr has been designed to remove the rust rings from the corneal surface or to smooth the pterygium bed in patients. It is a suitable device to create the desired LSCD model. It is a readily available, easy-to-use tool with a fine tip that makes it appropriate for working on small eyes, as in mice. Its application prevents unnecessary trauma to the eye and it does not result in unwanted injuries, as often is the case with chemical injury models. As opposed to a blunt scraper, it removes the epithelium with the basement membrane. In this protocol, the limbal area was abraded two times, and then the whole corneal epithelium was shaved from limbus to limbus. To avoid stroma injury, care was taken not to brush the corneal surface once the epithelium was already removed.

The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Medicina

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

Protocolli di danno alle fibre sensoriali corneali per studi sulla rigenerazione degli assoni

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sull'innervazione corneale attraverso modelli innovativi 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Neuroscienze

Mongolian Gerbils as an Animal Model of Wound Healing

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving patients' eye health. Historically, corneal healing has been studied in rodents such as mice and rats, but these models might not completely mimic human disorders. However, information on other rodents such as Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) is scant in corneal research.
Here, we describe a technique to develop a novel animal model for studying corneal healing after photorefractive keratectomy. Due to the limited literature available on the cornea of M. unguiculatus, we also describe a histological analysis of the normal cornea. These research techniques can also be employed in the study of eye diseases because of the similarity between the corneas of Mongolian gerbils and humans in terms of genetics, anatomy, and physiology.

This article describes a new animal model developed to study the anatomy and histology of the cornea and its healing processes. This new animal model uses the Mongolian gerbil, which has a cornea with many similarities to the human cornea.

Gerbilli mongoli come modello animale di guarigione delle ferite

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving ...

Guarigione delle ferite di abrasione epiteliale corneale con oculare Burr come un modello per Cornea

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Istituzione di un clinicamente rilevanti

Studiare la rigenerazione dei tessuti senza cicatrici nelle cornee embrionali dei pulcini feriti

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Un modello di abrasione epiteliale per lo studio della guarigione delle ferite corneali

Modelli animali ex vivo e in vivo per lesioni meccaniche e chimiche dell'epitelio corneale

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Tre strategie per indurre cheratite neurotrofica e rigenerazione nervosa nella cornea murina

Gerbilli mongoli come modello animale di guarigione delle ferite