Name: corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

カイサ Ikkala 中央研究質問への実装中に後でだけでなく、彼女の貴重な技術支援と洞察力に富んだヘルプこのメソッドを実現するときのために感謝したいと思います。獣医の仕事のガイドラインの計画に彼女の助けのため実験動物センターとアンナ Meller に感謝したいと思いますも。

すべての実験は、全国の動物実験委員会によって承認されています。
1. 準備
<ol><li>すべてのソリューションを準備し、特記されない場合はで部屋の温度を維持します。Dispose が使用される材料およびソリューション廃棄物規則に従ってください。</li>
	<li>使用当所と ICR ザイモグラム株、どちらかの性別と年齢 4-12 週の間。C57BL/6 株を使用している場合手順 1.3.2 でケタミン-メデトミジン調製法に従ってください。その他の手順については、1.3.3.-1.3.5 に記載されている指示に従います。</li>
	<li>新鮮で時間操作を開始する前に、獣医学を準備します。カルプロフェンは後で使用される、従ってこの時点でそれを準備する必要はありません。<ol>
<li>麻酔のケタミン-メデトミジンのソリューションを準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 ml (Ketaminol 獣医) ケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジン (Cepetor 獣医) の滅菌 0.9 %1.25 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 1 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>C57bl/6 マウスの麻酔のケタミン-メデトミジンのより希薄溶液を準備をするミックス 0.375 mL (濃度をストック 50 mg/mL) 0.25 mL とケタミンの (ストック濃度 1 mg/mL) メデトミジンの滅菌の 0.9% の 2.5 mL を加えると塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (3.75 mg/kg、ケタミン、メデトミジン 0.5 mg/kg) を管理します。 注: これは大人 c57bl/6 マウスの唯一の代替手順です。</li>
		<li>鎮痛のため buprenorfin を準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 0.3 mg/mL) 1.9 mL 滅菌の 0.9% に buprenorfin の塩化ナトリウム。0.2 mL/20 g のマウスの重量 (0.15 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>麻酔を中止のアチパメゾールを準備するには、0.1 mL を追加 (ストック濃度 5 mg/mL) の 0.9 %4.9 mL に対するアチパメゾールの塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウスの重量 (0.75 mg/kg) を管理します。</li>
		<li>鎮痛後麻酔中カルプロフェンを使用します。0.1 mL を追加 (ストック濃度 50 mg/mL) カルプロフェン 0.9 %4.9 ml の塩化ナトリウム。0.15 mL/20 g のマウス重量 (7.5 mg/kg) を管理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蛍光染色液を準備します。<ol>
<li>コバルト ブルーの光 (図 1) の下で耐摩耗性を可視化する蛍光ソリューションを使用します。微細なスケールとフルオレセイン塩の最初の測定 10 mg 0.1% フルオレセイン液を準備し、リン酸緩衝生理食塩水液 (PBS) で 10 mL に追加します。</li>
		<li>フルオレセイン溶液の光から保護、シェーカーで 5 分間振る。 注: フルオレセイン ソリューションは、光に敏感な;光からカバー ソリューションをしてください。このソリューションは、2 ~ 3 日は +4 ° C に格納できます。用では、点眼薬に使用されるスポイト ボトルにフルオレセイン ソリューションを配置することをお勧めします。ドロッパー ボトルにソリューションを移動するときは、滅菌フィルターを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前に、と使用後に眼のバリのヒントをきれいまず PBS とし、70 %etoh。場合同じ操作中にいくつかのマウスにキズを作って、各マウスのクリーニングの手順を行います。</li>
	<li>(37 ° C) の温水プレートを入れて、ペーパー タオルを置きます。</li>
</ol>2. 角膜上皮剥離
注意: とき防護服 (白衣、手袋) を使用してマウスを処理します。管理する薬の量を見積もるには、マウスの重量を量る。
<ol><li>片手スクラッフィング メソッドを使用して、マウス23を処理します。ケタミン-メデトミジン混合物を腹腔内管理 (i. p.) 左下腹部に。個々 のケージにマウスを置くし、眠りに落ちるを待ちます。これは通常 5 分未満がかかります。その後、最初の buprenorfin をクリックし、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。同じ処理テクニックを使用します。 注: 麻酔を指定すると、プロトコル必要があります一時停止できません任意の時点で。</li>
	<li>前に、加熱面が暖かいことを確認します。加熱平板上麻酔下のマウスを置きます。尾反射はつま先反射が存在が不在の場合は、麻酔のレベルをお勧めします。尾と、つま先の指または鉗子でつまんでこれらの反射を確認します。過度の力を使用しないでください。麻酔は、最後の 20-25 分です。</li>
	<li>キズをするためには、洗浄の眼のはりを使用します。摩耗させる振動をオンにするバリのベースを回転させます。バリが正しく機能しているとき、手に振動を感じる。<ol>
<li>別に指でまぶたを保持することによって一度に 1 つ目を開いています。その後しっかりとギザギザが角膜に触れるし、眼表面の楽器同様、前後の移動は横に限り。バリ振動はゼロ; を実行します。押して、振るか角膜を引き裂きます。角膜中央部 20 研磨表面の動きが傷を誘導するために十分です。バリを持ち上げ、磨耗する角膜の領域に滞在してください。標準サイズの摩耗を取得いくつかのラウンド練習が必要になります。</li>
	</ol>
 注: 角膜無菌は、betadine 点眼液を使用して摩耗する前に達成することができます。</li>
</ol>3. 摩耗のイメージング
<ol><li>コバルト ブルーのペンライト (図 1) とフルオレセインのソリューションを使用して研磨領域を照らします。眼の表面は周囲の光で無色の表示されます。フルオレセイン アプリケーション後研磨領域蛍光を発する緑色の光ペンで目を照らすとき。<ol>
<li>必要な場合、2.3 同様に研磨目を開き、ドロッパー ボトルからフルオレセイン液の一滴を管理します。PBS または 0.9% 回、目を洗う、フルオレセインの背景を減らすために、NaCl。洗浄用スポイト ボトルやピペットを使用します。ソフトのワイプで液体を離れて吸い出しなさいし、に応じて、まつげの汚れを落としてください。余分な液体は通常涙運河の開口部の近くに、目の鼻側の境界に収集します。 注意: は、マイナーな擦り傷が誘発されるかもしれないと cleaining、角膜に触れることを避けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>角膜上皮剥離の写真を撮る。<ol>
<li>各撮像セッション中に類似画像を取得するには、コバルト ブルーのペンライトと一眼レフ カメラ (図 2) の安定した添付ファイルのツールを使用します。このプロトコルは、(図 2) を繰り返しやすいセットアップを提供します。<ol>
<li>ペン ライトとカメラを添付するには、テーブル ランプ フレキシブル アームとクランプ調整可能なカメラの腕と、クランプでそれぞれ使用します。ケーブルタイ テーブル ランプとマウスの目のすぐ上の位置に光のペン。光を異なる位置決め、耐摩耗性の可視化を変更可能性があります。これらのツールを位置決めのための提案は、図 2で説明します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>目の写真を撮るための一眼レフ カメラを使用します。部屋の光に必要な距離と位置とフォーカス カメラ (1:12) に動物を配置します。その後、コバルト ブルーのペンライトを除く他のすべてのライトを閉じます。 注: をペン ライト ハンドルをテープまたはイメージ投射の間のすべての時間にライトを保つためにゴムバンドを使用します。これは、画像が不鮮明になる場合に役立つかもしれない。同僚とイメージング手順を実行する簡単です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 角膜上皮剥離後に目覚める
<ol><li>最初 buprenorfin し、i. p. 注射を介してアチパメゾールを管理します。2.1 と同じ処理方法を使用します。</li>
	<li>抗菌、フシジン酸酸眼軟膏 (Isathal) に潤いと麻酔後細菌からきれいな眼の表面を保つすりむいたと非摩耗の目に一滴を配置します。</li>
	<li>マウスは 5 ~ 20 分加熱平板上で美味しいが、麻酔後のウェイク アップ期間中にマウスを観察します。モバイルになれば、個々 のケージに配置します。 注: 目を覚ます時間がかかります、加熱パッドで檻の中にマウスを置くをクリックするか、または加熱平板上全体のケージに配置、マウスを定期的に監視します。麻酔が身に着けている間、マウスは通常振るし、体前葉と上向きに達する。この現象は、3-4 時間で正常に返す必要があります、共有ケージに戻るマウスをいただくことができます。</li>
	<li>手順 2.2 同様、摩耗後 2 日連続で鎮痛・眼軟膏のカルプロフェン i. p. を管理します。4.2 と。</li>
</ol>5. 創傷治癒過程におけるイメージング
<ol><li>このプロトコルで使用時間は、傷の閉鎖を観察する摩耗後の 18 h、72 h を指します。<ol>
<li>連続イメージング 2.2 で説明したように、マウスを麻酔します。</li>
		<li>3 で説明したように、写真を撮る。</li>
		<li>アチパメゾール i. p. を持つ動物を覚ます、4.3 で説明したように、ウェイク アップ期間を監視します。 注: いない場合はフォロー アップを継続、5.1.2 の直後にマウスを安楽死させます。安楽死は、6.1 で説明されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 角膜コレクションとパラフィン包埋
<ol><li>最後の時間以降は、動物を犠牲に。CO2を満たすことができるチャンバーにマウスを配置します。CO でチャンバー内の空気を埋める2.動物、モバイル、尾の根元からしっかりと引っ張ってくると同時に頸部を押し、頸椎を脱臼します。 注意: 常に動物愛護の体のガイドラインに従ってください。</li>
	<li>目の側に解剖はさみで皮膚の開口部を切断することによって全体の眼球を収集します。眼球の下ではさみを置き、軌道から目玉をポップに眼神経をカットします。目は簡単に出ない場合は、鉗子を使用します。<ol>
<li>眼の中のソリューションの無料浸透を許可する 26 G 針で網膜側で、目の後ろの穴を作る。 注: は、乾燥の代わりになる、プロトコルを続行まで PBS に目をさせてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS で 2 mL チューブに眼球を収集します。この時点で実験を一時停止しません。</li>
	<li>PBS を削除し、4 ~ 5 時間 +4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で眼球を修正します。</li>
	<li>組織カセット ティッシュの処理のために固定の眼球を移動します。組織の加工機械と次のプログラムを使用します。<ol>
<li>PBS で洗い。</li>
		<li>2 x 45 分 70% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>2 x 1 h 94% エタノール室温で孵化させなさい。</li>
		<li>室温での無水エタノールで 3 x 45 分を孵化させなさい。</li>
		<li>常温、37 ° C で最後キシレン キシレンの 3 x 1 h を孵化させなさい</li>
		<li>60 ° C でパラフィン ワックスで 3 × 1 h を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>処理組織後、眼球に埋め込む組織埋め込みブロックを使用した流動パラフィン (+ 60 の ° C)。ブロック内目を置き、それが横にいると周辺の境界線上を向いています。クール プレートに 5-10 分を固めるブロックができます。</li>
</ol>7. 角膜のパラフィン切片
<ol><li>機関のまたは製造元の指示に従って断面のミクロトームを準備します。 注意: は、シャープのミクロトーム刃を処理するとき注意してください。</li>
	<li>ミクロトームの横にある室内温純水と場所 1 浴と別超純水 +50 ° C に加熱</li>
	<li>眼球の 5 μ m 厚いセクションを確認します。 注: 断面中に簡単にレンズ改。これを避けるためには、セクションの新しい行を起動するたびに湿った組織切削の表面を拭いてください。ティッシュを湿らせて、水道水を使用します。</li>
	<li>室温水お風呂で互いに横にセクションを配置し、スライド グラスの助けを借りてお湯のお風呂に移動します。湯浴まですべてしわリラックスおよびセクションになるマット内のセクションをストレッチします。</li>
	<li>37 ° C で一晩のセクションのスライド ガラスを乾燥します。</li>
	<li>+60 ° C で加熱平板上 1 分スライドを維持することでセクションをスライドに添付します。この後、セクションことができます直接処理染色、免疫組織学的手法や +4 ° C で保存</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

負傷メソッドは、角膜の恒常性と病態のさまざまな側面を研究するための人気のあるツールです。耐摩耗性モデルでは、眼科に関連する問題に対処するため、よく制御された方法を提供しています。ただし、プロトコルの特定の重要なポイントは強調する価値が。特に、獣医、創傷治癒のタイムライン、および結果について説明詳細はザイモグラム技研や ICR 株式での使用に最適化されたが?...

多くの器官の上皮層は、傷害にさらされています。ただし、創傷治癒過程での組織の損失を賠償する能力も含まれます。角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供しています。それは眼の外部表面を形作り、敏感な眼機械の保護レイヤーを提供します。したがって、角膜は、病原体や水の損失に物理的な障壁として機能します。3 つの層から成り立っています上皮、実質、内皮細胞。角膜の上皮は角膜の最も外側の層になります。上皮細胞は互いにタイトな接合1,2,3を厳密に遵守することで角膜のバリア機能を維持します。無細胞性角膜基底膜、ボーマン膜は、難治性の実質細胞が含まれている広範な間質から上皮を分離します。実質の下で血管内皮細胞チャネル栄養素、水、および上位層への酸素。
角膜の傷、クリニック4で非常に一般的です。角膜への傷害は様々 で、主にほこりや砂、傷、または他の異物のような小さな粒子によって引き起こされます。プロトコルは、角膜上皮の摩耗、臨床的に関連するタイプを再現するために目的を紹介します。そうでは、このプロトコルは、臨床医や角膜科学者が独自の研究で実装するため制御し、精液メソッドを提供します。鈍く眼バリ、Algerbrush II と組織を研磨し、マウス角膜の体内の損傷修復アッセイを行った。ここでは、ターゲット中心部の角膜上皮にのみ耐摩耗と損傷することがなく器官の他の部分を残して。したがって、移行、増殖と分化体内5のセル プロトコルは再上皮化時に研究角膜上皮細胞や基底膜に最適です。最近では、このモデルは、前駆細胞の動態解析けが6、7の後角膜上皮幹細胞ニッチを再確立する差別化された角膜上皮細胞の容量を発表するだけでなくマウス角膜を分析に使用されました。次の摩耗、角膜はその通常の透明性、引張強さに返します。興味深いことに、その再上皮化が細胞増殖8なし発生する生体外で研究が示されます。このプロトコルでは、マウスの角膜で中断のない癒しのタイムラインについて説明します。したがって、メソッドは癒しのパターンと速度で薬の効果をテストする適用です。
角膜は、創傷治癒の研究に広く使用されています。しかし、多くの研究は、傷害の他のモデルに依存しています。9角膜表面にフィルター ペーパーの有無、角膜損傷の確立モデルは水酸化ナトリウム (NaOH) を適用することによって実行されるアルカリ火傷です。角膜の上皮だけでなく、結膜と実質9,10に影響大とびまん性損傷でアルカリ暴露します。強いアルカリ液は血管新生9混濁、角膜潰瘍を誘発する示されています。炎症細胞は、通常 6 時間以内実質に侵入し、24 h11までそこに残る。したがって、アルカリ外傷は間質の活性化に関連する研究のことをお勧め方法です。化学傷害の別のタイプは、角膜9,10ジメチルスルホキシド (DMSO) を適用することによって加えることができます。他の一般的に使用される傷害モデル、実質14,15の上の部分に制限されて実質と角膜切除の傷を貫通切開創の傷があります。これらのメソッドは、間質の創傷治癒に関する質問に回答もな。異なった傷害モデルには、独自の長所と短所があります。摩耗、または角膜の上皮のデブリードマンは最初鈍くメスやブレードを使用して前のヴィヴォ角膜16に開発されました。このメソッドは、使用される生体内でマウス、ラット、ウサギ17,18,19,20,21,22後されています。眼のはり (図 1) を使用して、我々 上皮の残りの部分は影響を受けないまま、上皮の選択した領域のみを削除します。このように、角膜のさまざまな部分に上皮の除去を細かく指定することが可能です。さらに、摩耗のサイズは、フルオレセイン染色と評価できます。さらに、ここで我々 は治癒期間中摩耗閉鎖を従います。
このメソッドは、いくつかの利点をもたらす、i) 化学損傷では不可能です、耐摩耗のサイトの正確な位置を含む ii) 耐摩耗性を実行するクイック、iii) 非侵襲的です。ここで、しかし、これはラット、ウサギ、ヒトの角膜障害を研究するために使用の一般的なモデルであるだけでなく遺伝的マウスモデルの広大な配列に適用される可能性がモデルとしてザイモグラムの当所のマウスを使用して方法を述べる.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>use sterile</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Market name: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Market name: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Market name: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Market name: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Market name: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Market name: Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline solution</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Blue pen light</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digital SLR camera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable camera arm and clamp</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Height 28 cm</td></tr><tr><td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection toolset</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue casette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing machine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

マウス角膜創傷治癒研究に優秀なモデルを提供します。角膜は、目の最も外側の層となる傷害に最初の防衛.実際には、クリニックの目傷害の最も一般的なタイプは角膜上皮剥離です。ここでは、角膜上皮、体内麻酔下マウスの除去、摩耗を誘発する眼バリを利用します。このメソッドは、ターゲットで再現可能な上皮の中断、その他の部分をそのままにできます。また、フルオレセイン染色とすりむいた上皮の可視化を記述する、すりむいた角膜を視覚化する方法について具体的なアドバイスを提供しています。創傷治癒の 0、18、および 72 時間後摩耗、傷は再 epithelialized までのタイムラインを従います。角膜損傷の上皮摩耗モデルは、上皮細胞の増殖, 移行および角膜の層の再上皮化に関する研究に最適です。ただし、このメソッドは眼のバリが間質細胞の層に浸透していないため創傷が治癒過程における間質の活性化を研究するが最適ではありません。このメソッドは、薬の効果の前臨床試験などの臨床応用に適しています。

このプロトコルは、マウス角膜への摩耗損傷を負わせるモデルについて説明し、従うし、摩耗後の癒しのプロセスを視覚化する方法を示唆しています。最近では、創傷治癒の6中に角膜上皮幹細胞の役割を研究するこのメソッドを採用しました。確立されたツールの使用は正常な摩耗実験への鍵です。我々 などは、擦り傷6,<...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K ビュー.  University of Helsinki. このプロトコルでは、マウスの眼球の表面に耐摩耗性を与えるし、創傷の治癒過程をその後に従うメソッドについて説明します。ハイパーカプニア マウスで目の表面の上皮を部分的に削除する眼はりのプロトコルを活用します。

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Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

発生生物学

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of transparency due to fibrotic scarring. The tissue integrity of injured embryonic corneas is intrinsically restored with no detectable scar formation. Given its accessibility and ease of manipulation, the chick embryo is an ideal model for studying scarless corneal wound repair. This protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. First, eggs are windowed at early embryonic ages to access the eye. Second, a series of in ovo physical manipulations to the extraembryonic membranes are conducted to ensure access to the eye is maintained through later stages of development, corresponding to when the three cellular layers of the cornea are formed. Third, linear cornea wounds that penetrate the outer epithelial layer and the anterior stroma are made using a microsurgical knife. The regeneration process or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure. Studies to date using this model have revealed that wounded embryonic corneas display activation of keratocyte differentiation, undergo coordinated remodeling of ECM proteins to their native three-dimensional macrostructure, and become adequately re-innervated by corneal sensory nerves. In the future, the potential impact of endogenous or exogenous factors on the regenerative process could be analyzed in healing corneas by using developmental biology techniques, such as tissue grafting, electroporation, retroviral infection, or bead implantation. The current strategy identifies the embryonic chick as a crucial experimental paradigm for elucidating the molecular and cellular factors coordinating scarless corneal wound healing.

The present protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. The regenerating or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure.&#160;

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with conjunctiva. Patients suffer from recurrent corneal defects, pain, inflammation, and loss of vision.
Previously, a murine model of LSCD was described and compared to two other models. The goal was to produce a consistent mouse model of LSCD that both mimics the phenotype in humans and lasts long enough to make it possible to study the disease pathophysiology and to evaluate new treatments. Here, the technique is described in more detail.
A motorized tool with a rotating burr has been designed to remove the rust rings from the corneal surface or to smooth the pterygium bed in patients. It is a suitable device to create the desired LSCD model. It is a readily available, easy-to-use tool with a fine tip that makes it appropriate for working on small eyes, as in mice. Its application prevents unnecessary trauma to the eye and it does not result in unwanted injuries, as often is the case with chemical injury models. As opposed to a blunt scraper, it removes the epithelium with the basement membrane. In this protocol, the limbal area was abraded two times, and then the whole corneal epithelium was shaved from limbus to limbus. To avoid stroma injury, care was taken not to brush the corneal surface once the epithelium was already removed.

The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

医学

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

軸索再生研究のための角膜感覚線維損傷プロトコル

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

著者スポットライト:革新的なモデルによる角膜神経支配研究の進歩 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

神経科学

Mongolian Gerbils as an Animal Model of Wound Healing

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving patients' eye health. Historically, corneal healing has been studied in rodents such as mice and rats, but these models might not completely mimic human disorders. However, information on other rodents such as Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) is scant in corneal research.
Here, we describe a technique to develop a novel animal model for studying corneal healing after photorefractive keratectomy. Due to the limited literature available on the cornea of M. unguiculatus, we also describe a histological analysis of the normal cornea. These research techniques can also be employed in the study of eye diseases because of the similarity between the corneas of Mongolian gerbils and humans in terms of genetics, anatomy, and physiology.

This article describes a new animal model developed to study the anatomy and histology of the cornea and its healing processes. This new animal model uses the Mongolian gerbil, which has a cornea with many similarities to the human cornea.

創傷治癒の動物モデルとしてのモンゴルスナネズミ

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving ...

角膜上皮摩耗眼はりのモデルとして角膜創傷治癒

要約

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臨床的に関連の確立

胚性創傷チック角膜における瘢痕のない組織再生の調査

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

角膜創傷治癒を研究するための上皮擦過傷モデル

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

創傷治癒の動物モデルとしてのモンゴルスナネズミ