Name: corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing
Uploaded: 2018-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Kaisa Ikkala por su invaluable asistencia técnica y ayuda perspicaz cuando actualizándose en este método, así como más tarde durante la aplicación a nuestras preguntas de investigación central. También queremos agradecer al centro de animales de laboratorio y Anna Meller por su ayuda con la planificación de las directrices de la labor veterinaria.

Todos los experimentos son aprobados por la Junta Nacional experimento animal.
1. preparaciones
<ol><li>Preparar todas las soluciones y guardar en temperatura ambiente, salvo indicación en contrario. Siga las regulaciones de eliminación de residuos a disponer utilizada materiales y soluciones.</li>
	<li>Uso NMRI y ICR marginado las existencias, entre 4-12 semanas de edad y sexo. Si se utiliza la cepa C57BL/6, siga el método de preparación de ketamina-medetomidina en paso 1.3.2. Para otras medidas, siga las instrucciones descritas en 1.3.3.-1.3.5.</li>
	<li>Preparar la medicina veterinaria fresco y a tiempo antes de iniciar la operación. Carprofeno se utilizará más adelante, así no es necesario preparar en este momento.<ol>
<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución de medetomidina ketamina para la anestesia, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina (Ketaminol veterinario) con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina (Cepetor veterinario) y añadir 1,25 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg y 1 mg/kg, medetomidina y ketamina).</li>
		<li>0,375 mL de la mezcla para preparar una solución más diluida de medetomidina ketamina para la anestesia en ratones C57BL/6, (stock concentración 50 mg/mL) de ketamina con 0.25 mL (concentración de la madre 1 mg/mL) de medetomidina y añadir 2,5 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (3.75 mg/kg y 0,5 mg/kg de medetomidina y ketamina). Nota: Este es un paso alternativo, sólo para adultos ratones C57BL/6.</li>
		<li>Para preparar buprenorfin analgesia, Añadir 0,1 mL (concentración madre 0,3 mg/mL) de buprenorfin a 1,9 mL de estéril 0,9% NaCl. Administrar 0,2 mL/20 g de peso del ratón (0,15 mg/kg).</li>
		<li>Para preparar atipamezole para descontinuar la anestesia, Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 5 mg/mL) de atipamezole a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (0,75 mg/kg).</li>
		<li>Para la analgesia durante la postanestesia usar carprofeno. Añadir 0,1 mL (archivo de concentración 50 mg/mL) de carprofeno a 4,9 mL de 0.9% NaCl. Administrar 0.15 mL/20 g de peso del ratón (7.5 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar la solución de tinción fluorescente<ol>
<li>Para la visualización de la abrasión bajo la luz azul cobalto (figura 1), utilice una solución fluorescente. Preparar una solución de fluoresceína 0.1% primera medición 10 mg de sal de fluoresceína con una escala fina y luego agregar a 10 mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
		<li>Proteger la solución de fluoresceína de la luz y agitar durante 5 minutos en un agitador. Nota: La solución de fluoresceína es sensible a la luz; mantener la solución de cubierta de la luz. Esta solución se puede conservar de + 4 ° C durante 2-3 días. Para el uso, es útil para la solución de fluoresceína en un gotero que se usa para las gotas. Utilice un filtro estéril al pasar la solución a la botella del cuentagotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpie la punta de fresa ocular antes y después de su uso; primero con el PBS y luego con el 70% EtOH. Si hace una abrasión a varios ratones durante la misma operación, siga los pasos de limpieza entre cada ratón.</li>
	<li>Poner la placa calentada en el (+ 37 ° C) y coloque una toalla de papel en él.</li>
</ol>2. corneal abrasión
PRECAUCIÓN: Use ropa protectora (bata, guantes) cuando manejo de ratones. Pesar el ratón para calcular el volumen del medicamento a administrar.
<ol><li>Utilice el método de scruffing una mano para manejar el ratón23. Administrar la mezcla de ketamina-medetomidina por vía intraperitoneal (i.p.) a la izquierda parte inferior del abdomen. Coloque el ratón en una jaula individual y esperar a dormirse. Esto normalmente toma menos de 5 minutos. Entonces, administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación. Nota: Una vez que se da la anestesia, el protocolo debe no ser pausado en cualquier momento.</li>
	<li>Antes de continuar, compruebe que la placa caliente es caliente. Coloque el ratón anestesiado en la placa de calefacción. El nivel de la anestesia es buena si está ausente el reflejo de la cola, pero el reflejo del dedo del pie está presente. Comprobar estos reflejos pellizcando la cola y cualquier dedo del pie con los dedos o pinzas. No use fuerza excesiva. Anestesia será durante 20-25 minutos.</li>
	<li>Para crear una abrasión, use las rebabas ocular limpia. Gire la base de las rebabas para activar la vibración que es imprescindible hacer la abrasión. Sentir la vibración en la mano, cuando la fresa está funcionando correctamente.<ol>
<li>Abrir un ojo a la vez manteniendo los párpados por separado con los dedos. Entonces firmemente tocar las rebabas a la córnea y mover el instrumento hacia adelante y hacia atrás así como hacia los lados en la superficie ocular. La vibración de la fresa realiza el cero; no presione, agitar o rasgar la córnea. En la córnea central, 20 movimientos en la superficie de abrasión son suficientes para inducir la herida. No levante las rebabas y tratar de permanecer en la región de la córnea para ser desgastado. Adquirir una abrasión de tamaño estándar se requieren varias rondas de práctica.</li>
	</ol>
 Nota: Se logra antes de abrasión Corneal asepsia utilizando betadine solución oftálmica.</li>
</ol>3. la proyección de imagen la abrasión
<ol><li>Se ilumina la región erosionada utilizando fluoresceína solución y luz de pluma azul cobalto (figura 1). La superficie ocular aparece descolorida en la luz ambiental. Después de la aplicación de fluoresceína, la región erosionada aparece en verde cuando se ilumina el ojo con el lápiz de luz.<ol>
<li>Si es necesario, abra los ojos desgastados semejantemente como en 2.3 y administrar una gota de solución de fluoresceína desde el frasco cuentagotas. Lave el ojo una vez con PBS o 0.9% NaCl para reducir el fondo de la fluoresceína. Use un gotero o una pipeta para el lavado. Aspirar el líquido, con una toallita suave y limpia las pestañas, si es necesario. El exceso de líquido se recoge generalmente la frontera nasal del ojo, cerca de la abertura del canal lagrimal. PRECAUCIÓN: Evite tocar la córnea al suplemento como abrasiones menores podrían ser inducidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tome fotos de la abrasión corneal.<ol>
<li>Para obtener imágenes similares durante cada sesión de imagen, herramientas accesorio constante para la luz de la pluma azul cobalto y la cámara (figura 2). Este protocolo proporciona una instalación fácil de repetir (figura 2).<ol>
<li>Para colocar la luz de la pluma y la cámara, utilice una lámpara de mesa con un brazo flexible y abrazadera y un brazo de cámara ajustable con una pinza, respectivamente. Atadura de cables el lápiz a la lámpara de mesa y la posición justo por encima de los ojos de ratón. Posicionamiento diferente la luz puede alterar la visualización de la abrasión. Una sugerencia para el posicionamiento de estas herramientas se describe en la figura 2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilice la cámara SLR para tomar fotografías del ojo. Coloque el animal en una distancia deseada y la posición y el enfoque la cámara (1:12) en la luz de la habitación. Después de eso, cerca de todas las luces excepto la luz de la pluma azul cobalto. Nota: La manija ligera de pluma de la cinta hacia abajo o utilizar una banda elástica para mantener la luz en todo el tiempo durante la proyección de imagen. Esto podría ayudar si la imagen se vuelve borrosa. Es más fácil llevar a cabo la etapa de proyección de imagen con un colega.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. despertar después de abrasión Corneal
<ol><li>Administrar buprenorfin primero y luego atipamezole mediante inyecciones i.p.. Utilice la misma técnica de manipulación como en 2.1.</li>
	<li>Coloque una gota de ungüento de ojo ácido antibacteriano, fucidin (Isathal) a los ojos desgastados y no desgastado para hidratar y mantener la superficie ocular limpio de bacterias después de la anestesia.</li>
	<li>Como el ratón se despertará en 5-20 minutos en la placa de calefacción, observar el ratón durante el período de reactivación Post-anestésico. Cuando se convierte en móvil, coloque en una jaula individual. Nota: Si despertar lleva más tiempo, coloque el ratón en la jaula con una almohadilla caliente o colocar la jaula entera en el plato caliente y supervisar regularmente el ratón. Mientras que la anestesia desaparece, el ratón típicamente sacude y llega hacia arriba con el cuerpo anterior. Este comportamiento debe volver a la normalidad en 3-4 horas y luego se puede colocar el ratón a una jaula compartida.</li>
	<li>Administrar carprofen i.p. para el ungüento de analgesia y el ojo en dos días consecutivos después de la abrasión, semejantemente como en los pasos 2.2. y 4.2.</li>
</ol>5. la proyección de imagen durante la cicatrización de heridas
<ol><li>En este protocolo, tiempo de uso puntos 18 h y 72 h después de la abrasión para observar el cierre de la herida.<ol>
<li>Imagen consecutiva, anestesiar los ratones como explicado en 2.2.</li>
		<li>Tomar fotografías como se explica en 3.</li>
		<li>Despertar de los animales con atipamezole i.p. y supervisar del periodo como se explica en 4.3. Nota: Si no continuar con el seguimiento, eutanasia el ratón después de 5.1.2. Eutanasia se describe en 6.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. córnea colección e inclusión en parafina
<ol><li>Después del último punto de tiempo, sacrificar el animal. Coloque el ratón en una cámara que puede estar llena de CO2. Llenan el aire de la cámara de CO2. Cuando el animal está inmóvil, dislocarse las vértebras cervicales tirando firmemente de la base de la cola y presionando la región del cuello al mismo tiempo. PRECAUCIÓN: Siempre seguir las directrices del cuerpo de protección de los animales locales.</li>
	<li>Recoger el globo ocular entero cortando una abertura en la piel al lado del ojo con las tijeras de disección. Colocar las tijeras en el globo ocular y cortar el nervio ocular para el globo ocular fuera de la órbita. Usar pinzas si el ojo no sale fácilmente.<ol>
<li>Hacer un agujero en la parte posterior del ojo, del lado de retina, con una aguja de 26G para permitir la libre penetración de soluciones dentro del ojo. Nota: No deje que el ojo se convierten en seco, en cambio, colocar en PBS hasta continuar con el protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger el globo ocular en un tubo de 2 mL con PBS. No hacer una pausa en el experimento en este momento.</li>
	<li>Quite la PBS y globos oculares en paraformaldehído al 4% (PFA) de + 4 ° C durante 4-5 horas.</li>
	<li>Mover el globo ocular fijo a una cinta de tejido para el proceso de tejido. Utilice un pañuelo de procesamiento de la máquina y el siguiente programa:<ol>
<li>Lavar con PBS.</li>
		<li>Incubar 2 x 45 min en etanol al 70% a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar h 2 x 1 en 94% de etanol a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 45 min en etanol absoluto a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en xileno, a temperatura ambiente y xileno pasado a 37 ° C.</li>
		<li>Incubar 3 x 1 h en parafina a 60 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de proceso de tejido, incorporar el globo ocular en parafina líquida (+ 60 ° C) usando un bloque de inclusión de tejidos. Colocar el ojo dentro del bloque de modo que mira hacia los lados y el borde periférico es hacia arriba. Que el bloque de solidificar en un plato fresco de 5 a 10 minutos.</li>
</ol>7. parafina secciones de la córnea
<ol><li>Preparar el microtomo para el seccionamiento según instrucciones de la institución o del fabricante. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manipular la cuchilla de micrótomo sharp.</li>
	<li>Lugar un baño María con agua ultrapura a temperatura ambiente al lado del microtomo y otro con agua ultrapura calientan a 50 ° C.</li>
	<li>Hacer secciones de 5 μm espesor del globo ocular. Nota: La lente se rompe fácilmente durante el seccionamiento. Para evitar esto, limpie la superficie con un paño húmedo cada vez que se inicia una nueva fila de secciones de corte. Utilizar agua para humedecer el tejido.</li>
	<li>Ponga las secciones al lado de uno al otro en el baño de agua temperatura ambiente y luego moverlos a la bañera de agua caliente con la ayuda de un portaobjetos de vidrio. Se extienden las secciones en el baño de agua caliente hasta relajación todas las arrugas y el mate de las secciones se convierten.</li>
	<li>Secar los portaobjetos de vidrio con secciones durante la noche a + 37 ° C.</li>
	<li>Coloque las secciones de las diapositivas manteniendo el portaobjetos durante 1 minuto en un plato caliente en + 60 ° C. Después de esto, las secciones pueden ser directamente procesadas para la coloración de immunohistological métodos o almacenadas a + 4 ° C.</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BALB/c+and+C57BL6+mouse+strains+vary+in+their+ability+to+heal+corneal+epithelial+debridement+wounds.">BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds.</a> Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).</li><li>. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques">https://www.jove.com/science-education/10221/rodent-handling-and-restraint-techniques</a> (2018)</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-matrix+and+cell-cell+interactions+during+corneal+epithelial+wound+healing.">Cell-matrix and cell-cell interactions during corneal epithelial wound healing.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 22 (2), 113-133 (2003).</li><li>Sato, Y., Seo, N., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+differences+between+FVB+and+C57BL/6+mice+affect+hypnotic+susceptibility+to+pentobarbital,+ketamine+and+nitrous+oxide,+but+not+isoflurane.">Genetic background differences between FVB and C57BL/6 mice affect hypnotic susceptibility to pentobarbital, ketamine and nitrous oxide, but not isoflurane.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 50 (5), 553-556 (2006).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K14+++Compound+niches+are+present+on+the+mouse+cornea+early+after+birth+and+expand+after+debridement+wounds.">K14 + Compound niches are present on the mouse cornea early after birth and expand after debridement wounds.</a> Developmental Dynamics. 245 (2), 132-143 (2016).</li><li>Boote, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Assessment+of+Ultrastructure+and+Light+Scatter+in+Mouse+Corneal+Debridement+Wounds.">Quantitative Assessment of Ultrastructure and Light Scatter in Mouse Corneal Debridement Wounds.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (6), 2786 (2012).</li><li>Pal-Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP9+cleavage+of+the+&#946;4+integrin+ectodomain+leads+to+recurrent+epithelial+erosions+in+mice.">MMP9 cleavage of the &#946;4 integrin ectodomain leads to recurrent epithelial erosions in mice.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 15), 2666-2675 (2011).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions:+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease.">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 45 (6), 1775-1788 (2004).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hería los métodos son herramientas populares para estudiar diferentes aspectos de la homeostasis de la córnea y patologías. El modelo de abrasión ofrece un método bien-controlado para hacer frente a problemas relevantes en Oftalmología. Sin embargo, ciertos puntos críticos en el protocolo son destacar. En particular, los detalles descritos en relación con la medicina veterinaria, herida curativa línea de tiempo y resultado están optimizados para el uso con cepas NMRI y ICR exogámica, pero pueden variar entre ...

Las capas epiteliales de numerosos órganos están expuestas a lesiones. Sin embargo, también contienen la capacidad de compensar la pérdida de tejido por medio de la cicatrización de heridas. La córnea ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. Forma la superficie externa del ojo y proporciona una capa protectora para la delicada maquinaria ocular. Así, la córnea funciona como una barrera física frente a patógenos y la pérdida de agua. Se compone de tres capas; epitelio, estroma y endotelio. El epitelio de la córnea es la capa más externa de la córnea. Las células epiteliales mantienen la función barrera de la córnea adhiriéndose estrictamente entre sí mediante uniones estrechas1,2,3. Membrana córnea acelular de la basal, la membrana de Bowman, separa el epitelio del estroma extensa, que contiene keratocytes refractaria. En el estroma, las células endoteliales canal de nutrientes, agua y oxígeno a la capa superior.
Abrasiones corneales son muy comunes en la clínica4. Lesiones en la córnea son diversas, pero en gran parte son causadas por pequeñas partículas como polvo o arena, arañazos u otros objetos extraños. El protocolo aquí había descrito pretende reproducir un tipo clínico de abrasión epitelial corneal. De esta manera, este protocolo proporciona un método controlable y seminal para los médicos y científicos corneales aplicar en sus estudios. Hemos realizado un ensayo de reparación en vivo lesiones en la córnea murina por causar lesiones en el tejido con una fresa rasgunõs ocular, el Algerbrush II. Aquí apuntamos la abrasión sólo al epitelio corneal central y dejar las otras partes del órgano sin daño. Así, el protocolo es ideal para el estudio de la célula epitelial corneal dinámica o la membrana basal durante re-epithelialization, célula de la migración, proliferación y diferenciación en vivo5. Recientemente, este modelo se utilizó para analizar la dinámica de la célula progenitora en la córnea murina, así como para conocer la capacidad de las células epiteliales corneales diferenciadas en el restablecimiento del nicho de células madre corneales después de lesión6,7. Después de la abrasión, la córnea vuelve a su normal transparencia y resistencia a la tracción. Curiosamente, un estudio en vitro indicó que re-epithelialization ocurre sin creciente de la célula proliferación8. Este protocolo describe la línea de tiempo de curación sin interrupciones en la córnea de ratón. Así, el método es aplicable para probar el efecto de las drogas en patrones y la velocidad de cicatrización.
La córnea se ha utilizado extensivamente para estudios de heridas. Sin embargo, muchos estudios han dependido de otros modelos de la lesión. Un modelo bien establecido de lesión corneal es la quemadura alcalina que se realiza mediante la aplicación de hidróxido de sodio (NaOH) con o sin papel de filtro sobre la superficie corneal9. Exposición alcalina produce una lesión grande y difusa que no sólo afecta el epitelio corneal, sino también la conjuntiva y el tejido conectador9,10. Soluciones alcalinas fuertes han demostrado inducir neovascularización9, opacificación y úlceras corneales. Las células inflamatorias invaden el estroma normalmente dentro de las 6 h y permanecen allí hasta las 24 h11. Por lo tanto, alcalino es un método recomendable en estudios relacionados con la activación stromal. Otro tipo de daño químico puede ser infligida por aplicar dimetilsulfóxido (DMSO) en la córnea9,10. Otros modelos de lesiones comúnmente usados incluyen heridas incisionales que penetran a través de las heridas de tejido conectador y keratectomy, que se limitan a la parte superior del tejido conectador14,15. Estos métodos también son útiles para responder a preguntas sobre cicatrización estromal. Lesiones diferentes modelos tienen sus ventajas y desventajas. Abrasión o desbridamiento, del epitelio corneal se desarrolló inicialmente utilizando bisturís rasgunõs o cuchillas en vivo ex córneas16. Este método ha sido más tarde usado en vivo en el ratón, rata y conejo17,18,19,20,21,22. Con las rebabas del ocular (figura 1), quitamos sólo una región seleccionada del epitelio, dejando el resto del epitelio afectado. Esta manera, es posible orientar precisamente la supresión epitelial a diferentes partes de la córnea. Además, el tamaño de la abrasión puede ser evaluado con la tinción de fluoresceína. Además, aquí seguimos cierre de abrasión durante el período de cicatrización.
Este método presenta varias ventajas, i) incluyendo la localización exacta del sitio de la abrasión, que no es posible con lesión química, ii) la abrasión es rápida de realizar, y iii) es no invasivo. Adjunto, describimos el método utilizando el ratón NMRI exogámica como modelo, sin embargo esto podría aplicarse a la amplia gama de modelos genéticos del ratón, así como a la rata y el conejo, que son modelos comunes utilizados para estudiar la interrupción córnea humana.

<table><tbody><tr><td>NMRI mouse</td><td>Envigo</td><td>275</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td></td><td></td><td>use sterile</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Vetmedic</td><td>Vnr087896</td><td>Market name: Cepetor Vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Market name: Ketaminol Vet</td></tr><tr><td>Buprenorfin</td><td>Invidior</td><td>3015248</td><td>Market name: Temgesic</td></tr><tr><td>Atipamezol</td><td>Orion Pharma</td><td>Vnr471953</td><td>Market name: Antisedan Vet</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vnr027579</td><td>Market name: Norocarp Vet</td></tr><tr><td>1% fucidin acid eye ointment</td><td>Dechra</td><td>Vnr080899</td><td>Market name: Isathal</td></tr><tr><td>Fluorescein salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline solution</td><td></td><td></td><td>PBS</td></tr><tr><td>Algerbrush ii ocular burr (0.5 mm tip)</td><td>Algerbrush</td><td>6.39768E+11</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Blue pen light</td><td>SP Services</td><td>DE/003</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Kunz Instruments</td><td>2007-0217</td><td></td></tr><tr><td>Digital SLR camera</td><td>Nikon</td><td>D80</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable camera arm and clamp</td><td>Neewer</td><td>10086132</td><td>Height 28 cm</td></tr><tr><td>Table lamp with a flexible arm and a clamp</td><td>Prisma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft wipe</td><td>KimtechScience</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>CO2 chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection toolset</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Beckton Dickinson</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Eppendorf tube</td><td>Sarstedt</td><td>689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue casette</td><td>Sakura Finetech</td><td>4118F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue processing machine ASP200S</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>UN1307</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Millipore</td><td>K95523361</td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedding mold 32 x 25 x 6 mm</td><td>Sakura Finetech</td><td>4123</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm</td><td>HM355</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Orthex</td><td>60591</td><td></td></tr><tr><td>Water bath for sectioning</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Microtome blade</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Th.Geyer GmbH &amp;amp; Co.</td><td>7,695,019</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Millipore</td><td>MPGP04001</td><td>MilliQ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>PFA</td></tr></tbody></table>

corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound healing

La córnea murina ofrece un excelente modelo para estudiar la cicatrización de heridas. La córnea es la capa más externa del ojo y es la primera defensa a la lesión. De hecho, el tipo más común de lesión de ojo encontrado en clínica es una abrasión corneal. Aquí, utilizamos un ocular burr para inducir una abrasión, resultando en la eliminación del epitelio corneal en vivo sobre ratones anestesiados. Este método permite la interrupción epitelial específica y reproducible, dejando otras áreas intactas. Además, describimos la visualización del epitelio erosionada con tinción de fluoresceína y proporcionar consejos concretos sobre cómo visualizar la córnea erosionada. Luego, seguimos la línea de tiempo de cicatrización 0, 18 y 72 h después de la abrasión, hasta que la herida es re-epithelialized. El modelo de abrasión epitelial de la lesión corneal es ideal para los estudios sobre proliferación de células epiteliales, la migración y la reepitelización de las capas corneales. Sin embargo, este método no es óptimo para estudiar la activación estroma durante la cicatrización de heridas, porque las rebabas del ocular no penetran a las capas de células estromales. Este método también es adecuado para aplicaciones clínicas, por ejemplo, pre-clínica prueba de eficacia de la droga.

Este protocolo describe un modelo para infligir una lesión de abrasión en la córnea de ratón y sugiere cómo seguir y visualizar el proceso de curación después de la abrasión. Recientemente, se empleó este método para estudiar el papel de células progenitoras epiteliales corneales durante6de cicatrización. El uso de herramientas establecidas es la clave para un experimento exitoso de la abrasión. Nosotros y otros, hemos utilizado las rebabas ocular Alge...

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Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...

corneal-epithelial-abrasion-with-ocular-burr-as-model-for-cornea

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K vistas.  University of Helsinki. Este protocolo describe un método para causar una abrasión en la superficie ocular del ratón y seguir la herida en proceso de curación después de eso. El protocolo aprovecha de una ocular rebabas a eliminar parcialmente el epitelio de superficie del ojo en ratones anestesiados.

Video: Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to follow and manipulate the wound response ex vivo in an environment that closely mimics that of epithelial tissue injury in vivo. This issue was addressed by creating a clinically relevant epithelial ex vivo injury-repair model based on cataract surgery. In this culture model, the response of the lens epithelium to wounding can be followed live in the cells&#8217; native microenvironment, and the molecular mediators of wound repair easily manipulated during the repair process. To prepare the cultures, lenses are removed from the eye and a small incision is made in the anterior of the lens from which the inner mass of lens fiber cells is removed. This procedure creates a circular wound on the posterior lens capsule, the thick basement membrane that surrounds the lens. This wound area where the fiber cells were attached is located just adjacent to a continuous monolayer of lens epithelial cells that remains linked to the lens capsule during the surgical procedure. The wounded epithelium, the cell type from which fiber cells are derived during development, responds to the injury of fiber cell removal by moving collectively across the wound area, led by a population of vimentin-rich repair cells whose mesenchymal progenitors are endogenous to the lens1. These properties are typical of a normal epithelial wound healing response. In this model, as in vivo, wound repair is dependent on signals supplied by the endogenous environment that is uniquely maintained in this ex vivo culture system, providing an ideal opportunity for discovery of the mechanisms that regulate repair of an epithelium following wounding.

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

Described here is the establishment of a clinically relevant ex vivo mock cataract surgery model that can be used to investigate mechanisms of the injury response of epithelial tissues within their native microenvironment.

Establecimiento de un punto de vista clínico relevante<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Catarata Mock Modelo de Cirugía en Investigando epitelial reparación de heridas en un microambiente Nativo

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Investigating Scarless Tissue Regeneration in Embryonic Wounded Chick Corneas

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of transparency due to fibrotic scarring. The tissue integrity of injured embryonic corneas is intrinsically restored with no detectable scar formation. Given its accessibility and ease of manipulation, the chick embryo is an ideal model for studying scarless corneal wound repair. This protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. First, eggs are windowed at early embryonic ages to access the eye. Second, a series of in ovo physical manipulations to the extraembryonic membranes are conducted to ensure access to the eye is maintained through later stages of development, corresponding to when the three cellular layers of the cornea are formed. Third, linear cornea wounds that penetrate the outer epithelial layer and the anterior stroma are made using a microsurgical knife. The regeneration process or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure. Studies to date using this model have revealed that wounded embryonic corneas display activation of keratocyte differentiation, undergo coordinated remodeling of ECM proteins to their native three-dimensional macrostructure, and become adequately re-innervated by corneal sensory nerves. In the future, the potential impact of endogenous or exogenous factors on the regenerative process could be analyzed in healing corneas by using developmental biology techniques, such as tissue grafting, electroporation, retroviral infection, or bead implantation. The current strategy identifies the embryonic chick as a crucial experimental paradigm for elucidating the molecular and cellular factors coordinating scarless corneal wound healing.

The present protocol demonstrates the different steps involved in wounding the cornea of an embryonic chick in ovo. The regenerating or fully restored corneas can be analyzed for regenerative potential using various cellular and molecular techniques following the wounding procedure.&#160;

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

Chick embryonic corneal wounds display a remarkable capacity to fully and rapidly regenerate, whereas adult wounded corneas experience a loss of ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with conjunctiva. Patients suffer from recurrent corneal defects, pain, inflammation, and loss of vision.
Previously, a murine model of LSCD was described and compared to two other models. The goal was to produce a consistent mouse model of LSCD that both mimics the phenotype in humans and lasts long enough to make it possible to study the disease pathophysiology and to evaluate new treatments. Here, the technique is described in more detail.
A motorized tool with a rotating burr has been designed to remove the rust rings from the corneal surface or to smooth the pterygium bed in patients. It is a suitable device to create the desired LSCD model. It is a readily available, easy-to-use tool with a fine tip that makes it appropriate for working on small eyes, as in mice. Its application prevents unnecessary trauma to the eye and it does not result in unwanted injuries, as often is the case with chemical injury models. As opposed to a blunt scraper, it removes the epithelium with the basement membrane. In this protocol, the limbal area was abraded two times, and then the whole corneal epithelium was shaved from limbus to limbus. To avoid stroma injury, care was taken not to brush the corneal surface once the epithelium was already removed.

The following article provides an easy, reproducible technique to effectively create a sustainable mouse model of limbal stem cell deficiency (LSCD). This animal model is useful in testing and comparing the efficacy of treatments for limbal stem cell diseases.

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Medicina

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its transparency. However, due to its external position, the cornea is highly susceptible to a wide variety of injuries that can lead to the loss of corneal transparency and eventual blindness. Efficient corneal wound healing in response to these injuries is pivotal for maintaining corneal homeostasis and preservation of corneal transparency and refractive capabilities. In events of compromised corneal wound healing, the cornea becomes vulnerable to infections, ulcerations, and scarring. Given the fundamental importance of corneal wound healing to the preservation of corneal transparency and vision, a better understanding of the normal corneal wound healing process is a prerequisite to understanding impaired corneal wound healing associated with infection and disease. Toward this goal, murine models of corneal wounding have proven useful in furthering our understanding of the corneal wound healing mechanisms operating under normal physiological conditions. Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion in mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. In this model, a 2 mm diameter circular trephine, centered over the cornea, is used to demarcate the wound area. The golf club spud is used with care to debride the epithelium and create a circular wound without damaging the corneal epithelial basement membrane. The resulting inflammatory response proceeds as a well-characterized cascade of cellular and molecular events that are critical for efficient wound healing. This simple corneal wound healing model is highly reproducible and well-published and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of disease.

Here, a protocol for creating a central corneal epithelial abrasion wound in the mouse using a trephine and a blunt golf club spud is described. This corneal wound healing model is highly reproducible and is now being used to evaluate compromised corneal wound healing in the context of diseases.

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

The cornea is critical for vision, accounting for about two-thirds of the refractive power of the eye. Crucial to the role of the cornea in vision is its ...

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, and result in a large, persistent corneal epithelial defect. Epithelial defect with the following corneal opacity and peripheral neovascularization result in irreversible visual impairment and hinder future management, especially keratoplasty. Since the animal model can be used as an effective drug development platform, models of corneal injury to the mouse and alkali burn to rabbit corneal epithelium are developed here. New Zealand white rabbit is used in the alkali burn model. Different concentrations of sodium hydroxide can be applied onto the central circular area of the cornea for 30 s under intramuscular and topical anesthesia. After copious isotonic normal saline irrigation, residual loose corneal epithelium was removed with corneal burr deep down to the Bowman's layer within this circular area. Wound healing was documented by fluorescein staining under Cobalt blue light. C57BL/6 mice were used in the traumatic model of murine corneal epithelium. The murine central cornea was marked using a skin punch, 2 mm in diameter, and then debrided by a corneal rust ring remover with a 0.5 mm burr under a stereomicroscope. These models can be prospectively used to validate the therapeutic effect of eye drops or mixed agents such as stem cells, which potentially facilitate corneal epithelial regeneration. By observing corneal opacity, peripheral neovascularization, and conjunctival congestion with stereomicroscope and imaging software, therapeutic effects in these animal models can be monitored.

Ex Vivo and In Vivo Animal Models for Mechanical and Chemical Injuries of Corneal Epithelium

Here, animal models based on mouse and rabbit are developed for mechanical and chemical injury of corneal epithelium to screen new therapeutics and the underlying mechanism.

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Corneal injury to the ocular surface, including chemical burn and trauma, may cause severe scarring, symblepharon, corneal limbal stem cells deficiency, ...

Protocolos de daño de las fibras sensoriales corneales para estudios de regeneración de axones

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Autor destacado: Avance de la investigación de la inervación corneal a través de modelos innovadores 

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Neurociencias

Mongolian Gerbils as an Animal Model of Wound Healing

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving patients' eye health. Historically, corneal healing has been studied in rodents such as mice and rats, but these models might not completely mimic human disorders. However, information on other rodents such as Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus) is scant in corneal research.
Here, we describe a technique to develop a novel animal model for studying corneal healing after photorefractive keratectomy. Due to the limited literature available on the cornea of M. unguiculatus, we also describe a histological analysis of the normal cornea. These research techniques can also be employed in the study of eye diseases because of the similarity between the corneas of Mongolian gerbils and humans in terms of genetics, anatomy, and physiology.

This article describes a new animal model developed to study the anatomy and histology of the cornea and its healing processes. This new animal model uses the Mongolian gerbil, which has a cornea with many similarities to the human cornea.

Los jerbos mongoles como modelo animal de curación de heridas

Corneal wound healing studies have been conducted for a long time and have helped to reduce suffering and develop treatments that contribute to improving ...

Cicatrización de heridas de abrasión epitelial corneal con rebabas Ocular como un modelo de córnea

Resumen

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Capítulos en este video

Establecimiento de un punto de vista clínico relevante

Investigando la regeneración de tejidos sin cicatrices en córneas embrionarias de pollitos heridos

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

Un modelo de abrasión epitelial para estudiar la cicatrización de heridas corneales

Modelos animales ex vivo e in vivo para lesiones mecánicas y químicas del epitelio corneal

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Tres estrategias para inducir queratitis neurotrófica y regeneración nerviosa en la córnea murina

Los jerbos mongoles como modelo animal de curación de heridas