Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre a geração de andaimes vascularizados, que são realmente o Santo Graal do campo de engenharia de tecidos. A principal vantagem dessa técnica é que uma bolsa pressurizada em uma orientação invertida melhora a descelularização de órgãos humanos não transplantáveis e nos permite fazer isso de forma estéril durante um período de tempo adequado. Para preparar o coração para a descelularização, primeiro realize uma inspeção interna para possíveis defeitos.
Se houver um defeito septo, corrija o defeito com as suturas apropriadas. Em seguida, liga as veias superiores e inferiores com sutura de seda 2-0. Suture a parede do átrio direito com 5-0 PROLENE, e disseque a aorta longe da artéria pulmonar principal para a cannulação subsequente.
Insira os conectores, de acordo com o diâmetro do vaso, na aorta e na artéria pulmonar, e fixe os conectores com suturas de seda 2-0. Usando um dos orifícios da veia pulmonar, insira uma linha de tubos através do átrio esquerdo em direção ao ventrículo esquerdo, e conecte uma linha de infusão ao conector na aorta e uma linha de saída ao conector na artéria pulmonar. Coloque o coração preparado em uma bolsa de poliéster na orientação invertida e coloque a bolsa em um recipiente de perfusão.
Conecte cada uma das linhas às respectivas portas na rolha de borracha, de acordo com o diâmetro do recipiente, e insira a rolha na tampa do recipiente de perfusão para selar a bolsa de poliéster. Em seguida, perfume PBS através da porta de infusão da rolha de borracha para verificar o fluxo da artéria pulmonar e da linha inserida no ventrículo esquerdo, utilizando este fluxo para limpar o órgão de quaisquer vestígios residuais de sangue dentro da vasculatura. Quando o coração estiver pronto, coloque o bioreator montado em uma orientação vertical e conecte a linha de infusão, linha de cabeça de pressão, linha de saída da artéria pulmonar e linha de drenagem bioreatorial para as portas da superfície da tampa de borracha em cima do bioreator de perfusão.
Em seguida, descelularizar o coração por quatro horas com solução hipertônica, duas horas com solução hipotônica, 120 horas com sulfato de dodecyl de sódio, ou SDS, e uma lavagem final com 120 litros de PBS, tudo sob constantes 120 milímetros de pressão de mercúrio medida na raiz aórtica. Durante os últimos 10 litros da lavagem PBS, adicione 500 mililitros de solução de ácido peracético estéril de 2,1% neutralizada com 10 hidróxido de sódio normal à solução de perfusão para esterilizar o andaime. Normalmente, a taxa de fluxo para a aorta durante o processo de descelularização diminui gradualmente à medida que a solução de perfusão muda de hipertônico para hipotônico.
Em contraste, a taxa de fluxo aumenta quando a solução de perfusão é alterada de uma solução hipotônica para SDS, momento em que a taxa de fluxo de infusão demonstra flutuações. A taxa de saída da artéria pulmonar demonstra uma tendência semelhante com as soluções hiper e hipotônicas. No entanto, a taxa de saída durante a perfusão do SDS apresenta uma redução geral.
A eficiência da perfusão coronária também diminui com o tempo à medida que os diferentes reagentes são perfundidos através da vasculatura. Como o fluxo de saída perfusado da artéria pulmonar e do ventrículo esquerdo são coletados simultaneamente, seu conteúdo de detritos pode ser comparado por espectroscopia. A turbidez do efluente de ambos os vasos diminui ao longo do tempo durante as perfusões, embora a turbidez da artéria pulmonar apresente uma mudança de cor mais abrupta em comparação com a observada do ventrículo esquerdo durante o período inicial de perfusão.
A avaliação da correlação entre a turbidez do fluxo e os detritos celulares por um ensaio de proteína de ácido bicinchonínico de seis corações humanos descelularizados revela uma correlação linear entre a concentração proteica e a turbidez do efluente. Ao tentar esse procedimento, é importante monitorar a vazão e coletar o perfusato periodicamente para realmente monitorar o processo de perfusão. Após este procedimento, outras técnicas como avaliação mecânica ou teste de esterilidade podem ser utilizadas para avaliar a fidelidade do andaime e seu potencial uso para recelularização para gerar um tecido cardíaco funcional.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo de medicina regenerativa e engenharia de tecidos explorarem a geração de órgãos vascularizados inteiros, mudando literalmente o campo de transplante de órgãos sólidos. Não se esqueça que trabalhar com órgãos humanos e tecidos e produtos químicos, como a SDS, pode ser extremamente perigoso, e sempre usar equipamentos de proteção pessoal adequados ao realizar este procedimento.
