Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
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We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Todos os passos descritos foram realizados sob protocolos aprovados pela Comissão de Biossegurança e do Comité do Hospital Infantil de Boston Institucional animal Cuidado e Uso. Hospital Infantil de Boston tem instalações rato isentos de agentes patogénicos com luz ciclos regulamentados / escuras e controle do clima. mudanças de gaiolas veterinários e de cuidados com os animais e garantir a saúde dos ratos. As instalações são AAALAC certificada e têm Animal Welfare Assurance certificação ativa (AAALAC acreditação concedida em 1992/02/24 Animal Welfare Assurance número:. A3303-01). Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO 2 entregues a partir de uma fonte de gás comprimido. As amostras de tecidos foram coletadas após a confirmação de que a frequência cardíaca, o movimento ea respiração dos animais tinha cessado. Roedores neonatais são resistentes ao CO 2 a eutanásia e foram sacrificados por decapitação utilizando uma tesoura afiada. Estes métodos são consistentes com as recomendações do Painel sobre a eutanásia da American Medica Veterinárial Association. 1. Construções de Geração de rAAV9 por clonagem de um ADNc ou shRNA cassete de expressão no esqueleto de plasmídeo NOTA: O plasmídeo rAAV9, contendo as repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2, usados ​​para a sobre-expressão do gene foi modificado para abrigar o TNNT2 galinha promotor (rAAV9.cTNT), que permite a expressão específica de cardiomiócitos de genes transduzidas 25,26,29. locais únicos Nhel e Kpnl foram introduzidos no plasmídeo, a jusante do promotor. Os fragmentos de ADNc que codificam os genes de interesse podem ser clonados no esqueleto rAAV9 usando estes dois locais de restrição 25,26,29. Aqui, como um exemplo, o vector rAAV9 por sobre-expressão do gene GFP no coração de ratinho foi gerado. O plasmídeo resultante contém a cassete de cTNT :: GFP flanqueado por duas ITR locais (Figura 1). construtos rAAV9.U6 :: shRNA foram usadas para o gene knockdown 25. Projeto shRNAs usandoonline de servidores de design shRNA. rAAV9.U6 :: shRNA pode ser gerado quer por hibridação e ligação de oligonucleótidos contendo sequências de ADN nos vectores de shRNA rAAV9 digerido com enzimas de restrição que albergam o promotor U6, ou por PCR de longo alcance e intra-molecular baseada em conjunto Gibson &quot;sem costura&quot; construção 30. O plasmídeo resultante contém a cassete deve U6-shRNA flanqueado por duas ITR locais (Figura 2). Aqui, como um exemplo, o vector rAAV9.U6 :: shRNA foi construído para knockdown de ARNm Trbp (sequência Trbp shRNA: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG). Uma precipitação shRNA foi utilizado como um controlo negativo (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG). <ol><li> Clone da cassete de expressão de ADNc ou shRNA na espinha dorsal do plasmídeo rAAV9. Transformar o ADN em células de E. coli competentes 25. NOTA: Use as células STBL2 ou stbl3 E. coli para transformação DNA rAAV9 para minimizar recombinação ITR indesejada. </li><li> Pegar oclone positivo a partir das células de E. coli transformadas. Amplificar a cultura em 500 ml de meio de Lilly-Barnett e extrair o plasmídeo rAAV9 a partir das células bacterianas 25-30. NOTA: Midi / Maxi prep do plasmídeo rAAV9 para se obter uma grande quantidade de ADN (&gt; 100 mg). Antes de gerar o vírus, sempre analisar a integridade da sequência dos plasmídeos de AAV por digestão de restrição e electroforese em gel de agarose, como previamente descrito (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> 2. Transfecção de células HEK293 com rAAV9 plasmídeos <ol><li> Prepare 1 ug / uL de solução de polietilenimina linear (PEI). Dissolver o pó em PEI dH livre de endotoxina 2 O que foi aquecida a 70-80 ° C. O arrefecimento até à TA, neutralizar a solução a pH 7,0 com HCl 1M. Filtrar esterilizar (0,22 mM) a solução. Alíquota da solução de estoque / ul PEI 1 mg (1,400 mL / tubo) e armazenar o solutião a -20 ° C. </li><li> células HEK293 Cultura em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Cultura das células num banho a 37 ° C incubadora com dióxido de carbono a 5 ± 0,5% (CO 2). </li><li> No dia 0, as células HEK293 placa em dez pratos de 150 mm 18-20 h antes da transfecção por divisão de&gt; 90% de células confluentes em uma diluição de 1: 2. NOTA: No dia 1, as células devem chegar a 90% de confluência. </li><li> No dia 1, transfectar células HEK293 com o plasmídeo rAAV9 (por exemplo, rAAV9.cTNT :: GFP ou rAAV6.U6 :: shRNA constrói), o plasmídeo Ad-Helper, e plasmídeo AAV-Rep / Cap usando PEI 25,26,29. <ol><li> Para 10 pratos de células em 90% de confluência, misturar 70 ug de plasmídeo de AAV-Rep / Cap, 70 ug de plasmídeo rAAV9 PF, e 200 ug de plasmídeo Ad-Helper em um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Se as células estiverem confluentes menos, ajustar a quantidade de ADN proporcionalmente. Por exemplo, se as células estão 75% confluentes, reduzir oquantidade de DNA proporcionalmente (75/90 do montante inscrito na etapa 2.4.1): misturar 70 x 75/90 = 58,3 mg de AAV-Rep / Cap plasmídeo, 70 x 75/90 = 58,3 ug de plasmídeo rAAV9, e 200 x 75/90 = 166,7 ug de plasmídeo Ad-Helper em um tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Adicionar 49 ml de RT DMEM (sem FBS) para o tubo de 50 ml e misturar bem. </li><li> Adicionar 1,360 ml de solução de PEI para fazer o PEI: ADN razão (v / w) ser de 4: 1. Misture bem. Incubar à temperatura ambiente durante 15 - 30 min. </li><li> Adicionar 5 ml da mistura preparada no passo 2.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml de mistura para dez pratos de 150 mm). </li></ol></li><li> Cultura das células em uma incubadora a 37 ° C com 5 ± 0,5% de CO 2 durante 60-72 horas. </li></ol> 3. Colheita de Transfectados HEK293 células e purificação de rAAV9 Vectors <ol><li> Colher as células 60-72 horas após transfecção. Desalojar e suspender as células em placas por pipetagem para cima e para baixo com o meio de cultura. Transferir todas as suspensões de células a estériltubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min. Ressuspender o sedimento de células com 5 ml de PBS em cada tubo e combinar todas as suspensões de células em um tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante. Neste passo, o sedimento celular armazenar a -80 ° C ou imediatamente purificar o AAV a partir do sedimento, como descrito nos passos 3.4-3.15. </li><li> Preparar o tampão de lise: NaCl 150 mM e Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. esterilizar filtro (0,22 mM). Armazenar o tampão a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de lise. </li><li> Congelar o lisado a -80 ° C ou no banho de gelo seco / etanol, em seguida, ele degelo a 37 ° C. Vortex durante 1 minuto. Congelamento e descongelamento, o lisado de 3 vezes. </li><li> Adicionar solução de MgCl 2 ao lisado descongelado (que a concentração final de MgCl2 no lisado ser 1 mM). Adicionar a nuclease para uma concentração final de 250 U / ml. Incubar a 37 ° C durante 15 min para dissolver o aggr ADN / proteínasegation. NOTA: Se a agregação de DNA / proteína não se dissolveu após nuclease ou endonuclease tratamento, Dounce homogeneizar os lisados ​​20 vezes. </li><li> Centrifugar a amostra a 4800 xg durante 20 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante. </li><li> Enquanto isso, prepare a solução gradiente Iodixanol: <ol><li> Prepara-se o 17% da solução gradiente por mistura de 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de 1 M de MgCl2, 0,125 ml de 1 M de KCl, 10 mL de NaCl 5 M, e 12,5 ml ofdensity meio de gradiente. Ajustar o volume total para 50 ml usando H 2 O. </li><li> Preparar a solução de 25% por mistura de 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de 1 M de MgCl2, 0,125 ml de 1 M de KCl, 20 mL de meio de gradiente de densidade, e 0,2 ml de 0,5% (w / v) de vermelho de fenol. Ajustar o volume total para 50 ml usando H 2 O. </li><li> Preparar a solução de 40% por mistura de 5 ml de PBS 10x, 0,05 ml de 1 M de MgCl2, 0,125 ml de 1 M de KCl, e 33,3 ml de meio de gradiente de densidade. Ajustar o volume total para 50 ml usandoH 2 O. </li><li> Preparar a solução de 60% por mistura de 0,05 ml de 1 M de MgCl2, 0,125 ml de 1 M de KCl, 50 mL de meio de gradiente de densidade, e 0,1 ml de 0,5% (w / v) de vermelho de fenol. </li></ol></li><li> Com uma agulha e seringa, carregar a solução gradiente de Iodixanol para dentro do tubo de polipropileno, na ordem de 5 ml de 17%, 5 ml de 25%, 5 ml de 40% e 5 ml de 60%, começando a partir do fundo. Carregar todo o lisado obtido a partir do passo 3.8 (14-16 ml) na parte superior do gradiente. O gradiente, listados a partir do fundo para o topo, é de 60%, 40%, 25%, 17%, e a camada de lisado. Encha o tubo com tampão de lise e cobri-lo com a cortiça. </li><li> Centrifugar a 185.000 xg durante 90 min a 16 ° C. </li><li> Colher a fracção viral (camada de 40%) com uma seringa. Inserir a agulha (calibre 21) para a intersecção entre as fracções 40% e 60%, apenas a camada de aspiração de 40%. Nota: Evite aspiração QUALQUER da camada de 25%. </li><li> Misture a fracção viral com esterilizado polioxietileno-polyoxyprosolução de copolímero de bloco de polipropi- PBS (10% de bloco de copolímero de polioxietileno-estoque polioxipropileno 1: 10.000 diluída em PBS) até um volume total de 15 ml. Carregar a mistura para dentro do tubo de filtro (cut-off molecular = 100 kD). Centrifugar a 2.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Descartar a solução na parte inferior. Encher o tubo de filtro com uma solução de PBS copolímero de bloco de polioxietileno-polioxipropileno com um volume total de 15 ml. Centrifugar a 2.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Repita este passo mais duas vezes. Recolhe-se o vírus purificado rAAV9 (a fracção acima do filtro). </li><li> Transferir a rAAV9 purificado no tubo de filtro para tubos de 1,7 mL. Alíquota da rAAV9 purificado (100-400 uL / ​​tubo, dependendo do volume e o título do AAV) e armazenar o vírus a -80 ° C. Nota: Evite congelamento-degelo repetidos. </li></ol> 4. Medição do título de rAAV9 <ol><li> Preparar as amostras de ADN padrão. <ol><li> Projetar PCR específica e eficienteprimers para vetores rAAV9 e otimizar a condição de PCR. NOTA: Os iniciadores utilizados neste estudo são &quot;Forward: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverso: TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot;. A reacção de PCR foi realizada com os seguintes condições: desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de 95 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 15 seg, e 72 ° C durante 10 seg; e a extensão final a 72 ° C durante 10 min. No entanto, os iniciadores e condições de PCR optimizadas são específicos do plasmídeo, tal como a sequência de inserção no vector rAAV9 pode afectar a especificidade e da eficiência da PCR 31. </li><li> Realizar a reacção de PCR com as condições mostradas no passo 4.1.1. Purifica-se o produto de PCR com um kit de extracção de gel. </li><li> Medir a concentração de ADN foi purificado utilizando um espectrofotómetro. Calcula-se a concentração em números moleculares de ADN com base no peso molecular / comprimento do produto de PCR. <ol><li> Calcular a concentração molecular utilizando a seguinte equação: MOconcentração lecular (moléculas de DNA ou fragmentos / ml) = 6,23 x 10 23 mol -1 x Con. x 10 -6 / MW. Nota: (6,23 x 10 mol -1 23 é o número de Avogadro; concentração Con .: ADN em ug / ml; MW .: peso molecular em g / mol). Por exemplo, se a concentração obtida do produto de PCR é de 100 ug / ml e o seu comprimento é de 200 pb, o peso molecular do DNA de cadeia dupla é de 2 x 200 x 310 = 124000 (o peso molecular médio de cada nucleótido no ADN de cadeia simples é de cerca de 310 g / mol). A concentração molecular (moléculas de ADN / ml) = 6.23 x 10 23 x 100 mol-1 ug / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 moléculas de DNA / ml. </li><li> Executar uma série de diluições do fragmento de ADN e preparar as amostras padrão, com concentrações de 13 a 10 moléculas / mL, 10 12 moléculas / mL, 10 11 moléculas / ml, 10 de 10 moléculas / mL, 10 9 moléculas / mL, 10 <sup&gt; 8 moléculas / ml, e 10 7 moléculas / ml. Use 1 ml de solução para cada amostra padrão para a PCR quantitativo (qPCR, no passo 4.6). </li></ol></li></ol></li><li> Misturar 5 mL de solução rAAV9 purificado com 5 ul de tampão de ADNase 10x, 1 ul de ADNase (10.000 U / ml), e 39 ul de ddH 2 O. O volume total deve ser de 50 ul. </li><li> Incubar o frasco a 37 ° C durante 30 minutos para remover o ADN de plasmídeo residual não embalados. </li><li> Inactivar ADNase a 95 ° C durante 10 min. Arrefecer a solução, adicionar 44 ul de H2O, 5 mL de tampão de ADNase 10x e 1 ul de estoque de Proteinase K (10 mg / ml). </li><li> Incubar a solução a 50 ° C durante 2 h. Parar a reacção e inactivar a proteinase K a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Use 1 ml da amostra para o ensaio de PCR quantitativo (qPCR). Calcula-se a título. <ol><li> Executar PCR quantitativo (qPCR) com os primers desenhados na etapa 4.1.1 utilizando as amostras fretapa om 4.1.4 (amostras padrão) e do passo 4,5 (amostras a ser medido). <ol><li> Para cada reacção, misturar 10 ul de 2x master mix verde (contendo a polimerase Taq, mistura de dNTP, tampão, MgCl2, e corante verde), 0,5 ul de iniciador directo (5 uM), 0,5 ul de iniciador reverso (5 ^ M), 8 ul de H 2 o, e 1 ul da amostra a ser medida. Realizar qPCR com as seguintes condições: manter as amostras a 50 ° C durante 2 min e 95 ° C durante 10 min; executar 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e a 60 ° C durante 1 min; para a fase de fusão, incubar as amostras a 95 ° C durante 30 seg e 60 ° C durante 15 seg. Gerar a curva padrão com base nos números de C T de amostras-padrão (Figura 3). </li></ol></li><li> Calcula-se a concentração molecular / titulação da amostra de AAV contra a curva padrão. O rAAV9 tem um genoma de ADN de cadeia simples, de modo que a concentração molecular será duas vezes maior do que ovalor calculado (2x potência (10, y), Figura 3B). Além disso, o título do rAAV9 purificado será 20 vezes maior do que o que é obtido a partir do cálculo em função da diluição do vírus em reacções de DNase e proteinase K (5 uL em 100 ul total) 01:20. </li></ol></li></ol> 5. Injeção rAAV9 em Ratos Neonatais e Ensaios de Expressão Gênica no Coração <ol><li> Preparar as soluções de trabalho rAAV9 em solução PBS copolímero em bloco de polioxietileno-polioxipropileno. Faça o estoque de vírus com os títulos de 1-7 x 10 12 partículas / ml. NOTA: Entregue 50-70 mL de solução rAAV9 para cada dia pós-natal 0,5-1,5 rato por injecção subcutânea. Para alcançar sobre-expressão eficiente de genes ou knockdown, recomenda-se realizar um teste piloto em cada estudo para optimizar a quantidade de AAV injetado. Use a mesma quantidade de controles rAAV9.U6 :: mexidos rAAV9.cTNT :: Luc ou para cada estudo para minimizar o preconceito. NOTA: Nós usamos 1-1,5x 10 11 partículas / filhote de cachorro para superexpressão e 2,5-5 x 10 11 partículas / filhote de cachorro para knockdown no dia pós-natal 0,5-1,5 mi ce). </li><li> Tratar ratos neonatal com rAAV9 em P0.5-P2.5 por injecção subcutânea. <ol><li> Pré-preencher a / 2, 0,33 x 12,7 mm seringa de insulina 29G1 com a solução rAAV9. Tenha cuidado para remover bolhas de ar. </li><li> Segure o filhote anestesiados-crio em uma mão com o polegar eo indicador. Antes da injecção, deslize para a pele do dorso do filhote com um escovilhão saturada com álcool isopropílico a 70%, para manter a condição de esterilizado. Inserir a agulha da seringa na hipoderme dorsal anterior do animal a um ângulo de 5 a 10 °. Injectar 50-70 ul da solução rAAV9 usando a seringa de insulina. NOTA: rAAV9 também pode ser entregue ao rato através de injecção intraperitoneal ou intravenosa 26,27. expressão eficaz dos genes entregues no coração pode ser obtido. No entanto, injeção intraperitonealião, por vezes, pode resultar na expressão gotejante no fígado. Após a injecção, a condição de as crias foi monitorizado diariamente. </li></ol></li><li> O nível de expressão do gene no coração pode ser monitorizada com qPCR, imunofluorescência, ou Western blot (resultados representativos são mostrados nas Figuras 4 e 5) 25,26. NOTA: Os ratos foram submetidos à eutanásia por CO 2 entregues a partir de uma fonte de gás comprimido. As amostras de tecidos foram coletadas após a confirmação de que a frequência cardíaca, movimento e respiração dos animais tinha cessado. Roedores neonatais são resistentes ao CO 2 a eutanásia e foram sacrificados por decapitação utilizando uma tesoura afiada. O método é consistente com as recomendações do Painel sobre a eutanásia da American Veterinary Medical Association. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

É importante minimizar a recombinação indesejada ITR durante a construção do plasmídeo. Antes de gerar o vírus, deve-se controlar sempre a integridade ITR dos plasmídeos de AAV, utilizando a digestão de restrição e electroforese em gel de agarose. É impossível obter 100% plasmídeos intactos, mas a razão de recombinação deve ser minimizado tanto quanto possível. Menos de 20% é aceitável para embalagem rAAV9 bem sucedida. De nota, a cultura das bactérias a temperatura mais baixa (30 ° C) com uma velo...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlando a expressão ou actividade de genes específicos em vários sistemas biológicos tornou-se uma estratégia terapêutica valiosa no estudo da função do gene 1. Uma forma directa de alcançar este objectivo é para manipular sequências de nucleótidos e de gerar alelos mutantes. Apesar de fazer, alterações específicas precisos para o genoma de células vivas ainda é um demorado e práticas de trabalho intensivo, o desenvolvimento das poderosas ferramentas TALEN e CRISPR / Cas9 abriu uma nova era de edição genoma 2-5. Um método de laboratório mais rotina para manipulação genética tem-se centrado sobre a introdução de materiais genéticos (DNAs e RNAs contendo sequências codificantes ou siRNAs / shRNAs) nas células de expressar ou knockdown do gene (s) de interesse 1,6. Em muitos casos, o principal ponto de estrangulamento para a manipulação de genes é a entrega de ADN, ARN, ou proteínas nas células. No que se refere a estudos in vitro, transfecti eficienteem sistemas foram estabelecidas em muitas linhas de células cultivadas. No entanto, no modelo de ratinho, em particular, na entrega de genes in vivo é mais difícil. Há uma série de barreiras extra e intracelulares que precisam ser contornado, de modo a conseguir a absorção celular eficiente dos reagentes exógenos. Obstáculos adicionais incluem a rápida depuração ea curta duração do 7,8 materiais entregues. Uma estratégia para contornar esses problemas é a utilização de vetores virais como &quot;portadores&quot; ou &quot;veículos&quot; para na entrega de genes in vivo. As propriedades de transdução naturalmente evoluídos de vírus permitir o fornecimento eficiente de um gene de interesse em células 7,9,10. Numerosos tipos de vectores virais têm sido desenvolvidos e permitir flexível na manipulação de genes in vivo em diferentes tipos de células e órgãos de ratinhos. Os sistemas virais mais comumente usadas incluem retrovírus, lentivírus, adenovírus, e vírus adeno-associado (AAV) <s-se&gt; 11. Os retrovírus são vírus de ARN de cadeia simples e pode introduzir o seu material genético para o genoma da célula hospedeira de uma forma estável durante a divisão mitótica, proporcionando o potencial para a expressão ao longo da vida dos genes transduzidas nas células e órgãos alvo 12-14. No entanto, muitos tipos de retrovírus apenas para infectar células em divisão, e a sua eficácia nas células que não se dividem 15 é muito baixa. Isto limita a sua utilidade para a entrega de genes. Lentivírus é um gênero da família Retroviridae. Diferente de outros retrovírus, lentivírus pode infectar tanto células em divisão e que não se dividem e tem sido amplamente utilizado para a transferência de genes em pós-mitótico e células altamente diferenciadas 16. O ciclo de vida de lentivírus também envolve a integração do ADN do vector no genoma do hospedeiro. Assim, a entrega de genes, mediada Lentivírus permite a expressão estável e de longa duração dos elementos genéticos transduzidas 16-18. No entanto, esse recurso pode representar um duplo-eespada DGED na utilização destes vírus para manipular a expressão de genes, a integração do DNA vector pode levar a mutagénese de inserção nas células hospedeiras e podem causar efeitos artefatuais. O adenovírus é um outro sistema de entrega de genes amplamente utilizado. Ao contrário dos retrovírus e lentivírus, adenovírus são não integrado e não interfere com a integridade genómica de células hospedeiras 8,10,11,19. Além disso, adenovírus pode transfectar ADN em muitos tipos de células, e a infecção não é dependente de divisão celular activa 19. Outra característica importante de adenovírus é a facilidade de purificação do vector, como os vectores virais têm a capacidade de ser replicado 19,20. No entanto, a ressalva importante deste sistema é que a infecção com adenovírus pode provocar fortes respostas imunitárias em células e órgãos alvo 19, limitando o seu uso em muitas investigações, particularmente em estudos de terapia génica. Comparado com estes diferentes tiposs de vectores virais, vírus recombinante adeno-associado (rAAV) parece ser o sistema de entrega de genes ideal 21,22. Ela exibe imunogenicidade mínima e patogenicidade 23,24. Além disso, de rAAV infecta uma ampla gama de tipos de células, incluindo ambas as células que não se dividem e divisória. Na maioria dos casos, rAAV não se integra nos genomas de acolhimento; Assim, o risco de alterações genéticas ou genómicas indesejáveis nas células alvo é baixa 22. Recentemente, sistemas de rAAV foram usadas com êxito para a administração in vivo de ADN que codifica proteínas, miARNs, shRNAs, e CRISPR-gRNAs no músculo cardíaco do rato 23,25-29. Esta metodologia tem facilitado investigações fundamentais e estudos de terapia gênica no domínio da investigação cardiovascular. Aqui, o procedimento detalhado para gerar vectores rAAV9 que sobre-expressam de forma eficiente ou eliminação dos genes de interesse em corações de rato foi descrito. O protocolo proporciona um método simples e eficaz demanipular a expressão de genes cardíacos em modelos experimentais de murino.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease, ultrapure</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Medium(Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pipetting needle with 90&amp;deg; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution (Pluronic&amp;reg; F-68 solution)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 vector</td><td>Penn Vector Core</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

Controlando a expressão ou actividade de genes específicos por meio da entrega de materiais genéticos miocárdica em modelos de murino permite a investigação de funções de genes. O seu potencial terapêutico no coração pode também ser determinada. Existem abordagens limitadas para a intervenção molecular in vivo, no coração de rato. Vírus adeno-associado (rAAV) engenharia de genoma baseada recombinante tem sido utilizada como uma ferramenta essencial para a manipulação genética cardíaca in vivo. As vantagens específicas de esta tecnologia incluem alta eficiência, de alta especificidade, baixa taxa de integração genómica, mínimo imunogenicidade, patogenicidade e mínima. Aqui, é descrito um procedimento detalhado para a construção, pacote, e purificar os vetores rAAV9. A injecção subcutânea de rAAV9 em crias recém-nascidos resulta em expressão robusta ou knockdown eficiente do gene (s) de interesse no coração de rato, mas não no fígado e outros tecidos. Usando o cardíaca-específiObteve-se C TNNT2 promotor, elevada expressão do gene GFP no coração. Além disso, sequências alvo de ARNm foi inibida no coração quando um rAAV9-U6-shRNA foi utilizado. Trabalhando conhecimento da tecnologia rAAV9 pode ser útil para as investigações cardiovasculares.

As estratégias para a construção de plasmídeos rAAV9 rAAV9.U6 :: shRNA rAAV9.cTNT :: GFP ou são mostrados nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Como os exemplos, o vector foi gerado rAAV9 para sobre-expressar o gene GFP em corações de rato. O plasmídeo resultante contém a cassete de cTNT :: GFP flanqueado por duas ITR locais (Figura 1). O vector rAAV9.U6 :: shRNA foi construído para knockdown de ARNm Trbp (Figura 2)</stro...

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Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K visualizações.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

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Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Entrega de mRNA modificado em um modelo de mouse de infarto do miocárdio

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Genética

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biologia

Transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor em destaque: Transgênese de células cardíacas para triagem rápida de genes

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Biologia do Desenvolvimento

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medicina

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Silenciamento seletivo de genes no plexo coróide

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Autor em destaque: Insights e inovações em técnicas de manipulação de expressão gênica para pesquisa do plexo coróide 

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Resumo

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Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal

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Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato

Avaliação in vitro da reprogramação cardíaca medindo fluxo de cálcio específico cardíaco com um repórter GCaMP3

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide

Knockdown direcionado de genes no plexo coroide