The research was supported by the University of Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil (Addgene plasmid # 61883). We thank Tihomir S. Dodev for useful discussions regarding pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;.

NOTA: Um vector de expressão de mamífero adequado deve ser utilizado para este protocolo. Aqui, uma única construção que contém duas cassetes de expressão é utilizado (isto é, expressão da cadeia pesada e leve é conduzida por promotores separados). Trastuzumab cadeias pesadas e leves foram previamente clonado no vector. Este vector foi um presente de Andrew Beavil, obtido através de um lucro não-para-repositório plasmídeo 13. 1. Recuperação e scale-up de DNA Vector NOTA: O ADN do vector foi recebido como uma cultura Stab agar mole em Escherichia coli XL-1 Blue estirpe; vector transporta resistência à higromicina. <ol><li> Insira uma facada inoculação estéril ou alça no agar macio da cultura facada em seguida, raia uma placa de agar Luria Bertani (LB) preparado com 75 ug / ml de higromicina para colónias isoladas. Incubar a placa a 37 ° C durante 18-24 h. </li><li> Inocular uma colónia isolada em 5 ml de caldo Terrific (TB) contendo 75 ug / ml de higromicina. incuBATE a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm. </li><li> Utilizar a cultura durante a noite para preparar um stock de glicerol de ADN do vector misturando suavemente a 800 ul de cultura com 200 ul de 80% de glicerol num criotubo e congelamento a -80 ° C. <ol><li> Adicionar 100 ul da cultura durante a noite a 100 ml de TB contendo 75 ug / ml de higromicina num balão agitador confundido (isto é, diluição 1 / 1.000). Incubar a cultura a 37 ° C durante 18-24 horas com agitação 225 rpm. </li></ol></li><li> Após cultura durante a noite, extrai-se e purifica-se o ADN de acordo com as instruções do fabricante do kit de preparação MIDI / Maxi com a seguinte excepção; durante o passo de, ou eluem ressuspender o ADN final com água (pH 7,0-8,5). </li><li> Verifique a pureza e concentração de DNA por leituras de absorvância a 260 e 280 nm, em seguida, armazena o ADN à temperatura de -20 ° C. NOTA: Opcional (altamente recomendado): DNA Sequence utilizando primers específicos de vetor para confirmar a identidade. </li></ol> 2. Transfecção estável de células HEK 293- <ol><li> Crescer e manter as células HEK-293 (células de suspensão) de acordo com protocolos padrão em meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico em balões de Erlenmeyer. Mantem-se a 2 x 10 5 culas / ml e subcultura cada quarto dia. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm. NOTA: As células devem ter sido em cultura por não menos de 4 dias e não mais de 4 semanas antes da transfecção. As células HEK-293 crescidas como monocamadas em meio contendo soro, também pode ser usado para este procedimento. </li><li> No dia antes da transfecção, as células HEK-293 de sementes a 3 x 10 5 culas / ml em poços de uma placa de 12 poços em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Meios (DMEM) suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% ( FBS). No dia da transfecção, verificar que as células atingiram 80-90% de confluência </li><li> Diluir DNA e polietilenimina (PEI) separadamente em meios de transfecção, em seguida, misture bem.<ol><li> Dilui-se 1,25 ^ g de DNA vector por poço (15 ug por 12 poços) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Dilui-se 2,5 ul de solução de 1 mg / ml de PEI (30 uL para poços 12; ou seja, 1: 2 proporção de ADN para pei) em 300 ul de meio de transfecção. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Adicionar ADN diluído para PEI diluído, misturar suavemente e incuba-se à temperatura ambiente durante 15 min. </li></ol></li><li> Adicionar 50 ul de ADN / PEI mistura gota a gota a cada poço da placa. Balance a placa suavemente para distribuir a mistura de transfecção, em seguida, colocar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Adicionar 50 ug / ml de higromicina B por poço e retornar placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 dias. NOTA: Ao dia 10, as células transfectadas un-terão morrido e isolada a partir da superfície da placa, enquanto que as células estavelmente transfectadas serão viáveis ​​e ligado à placa. </li><li> Substitua o material em poços com1/4 volume de meio isento de soro e 3/4 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, 0,5 ml de meio isento de soro + 1,5 ml de DMEM = 7,5% de concentração sérica final) e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 1/2 meios isentos de soro de volume e 1/2 volume de DMEM suplementado com FBS a 10% (isto é, meios isentos de soro 1 ml + 1 ml de DMEM = concentração de soro final de 5%) e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 3/4 meios isentos de soro de volume e 1/4 volume de DMEM suplementado com FBS (isto é, 1,5 ml de meio isento de soro + 0,5 ml de DMEM = concentração sérica final de 2,5%) a 10% e incubar durante 4 dias. </li><li> Substituir os meios de comunicação em poços com 2 ml de meio isento de soro suplementado com 0,1% de agente tensioactivo não iónico (isto é, a concentração sérica final 0%) e incubar durante 4 dias. NOTA: Manter a 50 ug / pressão selectiva higromicina B ml de células durante a adaptação sem soro. As células adaptadas a meio sem soro separar da superfície de poços e podem agrupar-iN suspensão. Consulte o passo 2.1 para condições de cultura com o suplemento adicional de 50 ug / ml de higromicina B. </li><li> Usando uma pipeta, misturar suavemente as culturas em suspensão as células em placa e da piscina de 12 poços para um tubo separado. <ol><li> Usando um hemocitómetro, enumerar células reunidas e sementes em 30 ml de meio isento de soro, num balão de Erlenmeyer a 2 x 10 5 culas / ml. Células de cultura a 37 ° C com 5% de CO 2 e 120 rotação rpm. Subcultura e expandir cada quatro dias. </li></ol></li><li> Continuar a expandir o tamanho da cultura a densidade celular necessária para obter 10 frascos a 1 x 10 7 células / frasco de criopreservação em azoto líquido. Congelar as células em meio isento de soro contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: condicionado mídia contendo o anticorpo pode ser colhido em cada subcultura para confirmar a produção de proteína ou usado para otimizar as condições de purificação. Para colher os meios condicionados e manter células para subcultura, centrifugar a cultura em300 xg durante 5 min e depois filtrar-esterilizar sobrenadante através de um filtro de 0,22 um. sobrenadante filtrado pode ser mantida a 4 ° C durante 1-2 semanas ou -20 ° C para armazenamento a longo prazo. </li></ol> 3. Grande Escala da Produção de Anticorpos de lote Overgrow Cultura NOTA: A produção de anticorpos pode ser seguido por passo de 2,11, onde as células existentes são expandidos para a densidade celular necessária com base no volume de cultura overgrow lote a configuração. Caso contrário, as células que foram descongelados a partir de criopreservação começar nesta fase uma vez expandido até uma densidade celular apropriada e volume. Vários suplementos de cultura podem ser utilizados para optimizar a produção de anticorpos; o uso de triptona para aumentar o rendimento de anticorpo é demonstrado no presente protocolo. <ol><li> Semear as células a 2 x 10 5 culas / ml em meio isento de soro de 100 mL em dois frascos de Erlenmeyer (comparar os rendimentos de anticorpo a partir de culturas de un-suplementado e suplementada em nutrientes). Cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 </sUB&gt; e 120 rpm. </li><li> Após 24 h, adicionar triptona até uma concentração final de 0,5% de cultura suplementado com nutrientes. Equalizar volume de cultura suplementado-un com meios livres de soro. </li><li> A partir do dia 8, realizar contagens de células das culturas diários utilizando um hemocitómetro para monitorar a viabilidade celular. Colheita dos sobrenadantes de cultura uma vez que a viabilidade das células é inferior a 80%. <ol><li> Colheita sobrenadante por centrifugação das culturas a 3000 xg durante 15 min e depois filtrar-esterilizar o sobrenadante (contendo o anticorpo) através de um filtro de 0,22 um. Armazenar os sobrenadantes a 4 ° C (de curto prazo) ou congelar a -20 ° C (a longo prazo). </li></ol></li></ol> 4. Anticorpo A purificação por cromatografia de afinidade usando um Cromatografia Líquida de Proteínas Rápida automatizada (FPLC) do sistema NOTA: O procedimento que se segue pode geralmente ser aplicada a sistemas mais automatizados. A purificação pode ser realizada à temperatura ambiente ou a 4 ° C (sistema FPLC se é mantida numa sala fria).Uma série de testes de aferição pode ser realizada para identificar as condições óptimas de purificação incluindo a matriz de coluna adequada, tampão, tampão de eluição e do pH de ligação para assegurar a recuperação máxima de anticorpo purificado a partir de meios condicionados (consulte a secção de resultados). As condições óptimas são dependentes do anticorpo ou proteína ser purificado. Purificações foram realizadas num sistema de FPLC automatizado. Purificações foram realizadas à temperatura ambiente usando uma coluna 5 ml de Proteína A coluna. <ol><li> Prepare os seguintes tampões com água ultrapura e ajustar ao pH recomendado, em seguida, filtrar através de um filtro de 0,22 um. <ol><li> Prepare 1 litro de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 (tampão de ligação) através da mistura do seguinte: 0,14 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,01 M de Na 2 HPO 4 e 0,001 M de KH 2 PO 4. Ajuste o pH se necessário, antes de se filtrar o tampão. </li><li> Preparar 500 ml de M de glicina-HCl a pH 2,7 (tampão de eluição) 0,1. Ajustar o pH antes de filtrar o lustreer. </li><li> Preparar 50 ml de Tris pH (tampão de neutralização) 9,0 1. </li></ol></li><li> Certifique-se de todas as conexões eléctricas e de comunicação do sistema com computador são feitas. Os dispositivos devem ser visíveis no software do módulo &#39;Sistema de Controle&#39;. Assegurar célula UV é fixado em 280 nm, comprimento de onda. Opcional: Calibrar medidor de pH, se estiver ligado e para ser usado. </li><li> Imergir tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura para lavar o sistema. Purifica as bombas com uma seringa, se houver ar no tubo ou uma suspeita de ar no sistema. Lavar o sistema com água por operação manual através do controlador de sistema, ou através de um método automatizado. Observe que a pressão, condutividade, traçado UV280 e pH permaneçam consistentes e que o limite de pressão para a coluna não seja excedido de acordo com as especificações do fabricante. NOTA: Anormalidades pode indicar ar ou bloqueio no sistema que devem ser abordadas antes de prosseguir. </li><li> No módulo controlador do sistema, inicie o caudal ao 1ml / min manualmente através de bomba A em qualquer carga (ignorando loop de amostra) ou injetar (através do loop de amostra) posição para começar a ligar a coluna. tubulação do sistema de desconexão na entrada posição da coluna e retire a tampa ligada à entrada da coluna. <ol><li> Permitir que a água flua do tubo de gota a gota do sistema na parte superior da coluna, em seguida, fixar a tubagem do sistema para a coluna. Ter a entrada da coluna e acessório de entrada transbordando com gotas de água garante uma conexão livre de bolhas de ar. </li></ol></li><li> Fixe a saída da coluna na saída a jusante e verificar todas as conexões estão bem apertados. Com a coluna agora ligado ao sistema, não exceder os limites de limite de pressão máxima e caudal, conforme descrito nas especificações da coluna. </li><li> Lavagem da coluna com 5 volumes de coluna (CV) de água. Se necessário, continue lavagem da coluna até UV280 traçado estabilizou. </li><li> Mergulhe tubos de entrada de A em tampão de ligação B na eluição de tampão e bomba da amostra em tampão de ligação tO equilibrar o sistema em tampões correcção. Encha os tubos de entrada com tampão usando PumpWash pela operação manual. </li><li> No módulo do software do &#39;Method Editor&#39;, utilize o assistente método para configurar um método de cromatografia de afinidade para a coluna que se destina a ser utilizado. NOTA: Sistemas automáticos de FPLC vêm com métodos pré-cheias com as configurações recomendadas (ou seja, vazão e limite de pressão) e execute os passos com base na coluna (fabricante, matriz e tamanho) seleccionado para a purificação. <ol><li> Use as seguintes etapas de execução para Proteína A cromatografia de afinidade: <ol><li> sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos. </li><li> amostra de carga para a coluna (volume a ser carregado é especificada manualmente no método) e recolher flowthrough para um recipiente separado. </li><li> sistema de lavagem com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough em um recipiente separado. </li><li> coluna eluir com 5 CV isocratIC fraccionamento utilizando tampão de eluição e recolher amostras de anticorpo purificado em fracções por colector de fracções. </li><li> sistema de equilibrar com 5 CV de tampão de ligação e recolher flowthrough no recipiente de resíduos. </li></ol></li></ol></li><li> Uma vez que o método tem sido de configuração, especificar o volume de meio condicionado a ser aplicada à coluna e guardar o método. NOTA: O volume especificado no método deve ser de 5-10 ml menos do que o volume real para evitar a introdução de ar durante o exemplo de execução. O volume especificado utilizado neste protocolo é 90-120 ml. </li><li> Submergir o tubo de bomba da amostra para dentro do vaso que contém o meio condicionado. </li><li> Preparar um recipiente separado para recolher flowthrough amostra através do tubo de saída especificada. NOTA: É importante recolher o flowthrough no caso ocorre um erro durante a execução ou a capacidade de ligação da coluna é excedido exigindo a flowthrough para ser reaplicada para a coluna ou a purificação repeated. </li><li> Prepare tubos de coleta no coletor de fração. Adicionar 100 ul de tampão de neutralização por 1 ml de volume de fracção. O sistema de FPLC irá eluir automaticamente as fracções em tubos de colheita. </li><li> No módulo do software do &#39;Sistema de Controle&#39;, abra o método a ser executado. NOTA: O método de execução é iniciado em uma série de páginas que incluem a verificação das variáveis ​​do método, a configuração do coletor de frações e definir o nome arquivo de resultado e local de armazenamento. </li><li> Clique em Iniciar para iniciar a execução. O prazo pode ser monitorado no módulo do &#39;Sistema de Controle&#39;. </li><li> Após a conclusão da purificação prazo, verificar o cromatograma resultando no módulo &#39;Avaliação&#39; no software do sistema. </li><li> Combinar todas as fracções contendo proteína num tubo, a troca de tampão separada e concentra-se em PBS utilizando um dispositivo de filtro de centrífuga com 30 kDa de peso molecular de corte. Realize os passos de centrifugação de acordo com o fabricante doinstruções. </li><li> Medir a concentração de anticorpo utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Se outra purificação prazo é para ser realizado, privilegiada a tubulação da bomba de amostra em tampão de ligação e repita os passos 4,9-4,14. </li><li> Na conclusão de corridas de purificação, mergulhe tubos de entrada de A, B e bomba da amostra em água ultrapura e lavar o sistema e coluna como executou na etapa 3. </li><li> Submergir A, B e tubulação da bomba de exemplo no procedimento de lavagem 20% de etanol e repita para o armazenamento do sistema e coluna. </li><li> Desligue a coluna da tomada a jusante e substituir rolha de coluna, em seguida, desligue coluna na entrada e substituir tampa, volte a ligar a tubulação para o sistema. Armazenar na coluna a 4 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments.">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li><li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates:+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety.">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li><li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bispecific+antibodies.">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li><li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies.">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Food and Drug Administration. 22, (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Medicines Agency. 13, (2014).</li><li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab.">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235 (2015).</li><li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+characterization+of+Remsima.">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li><li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab.">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies.">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li><li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus.">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li><li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines.">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li><li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies.">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885 (2014).</li><li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals.">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g/l+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions.">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96 (2008).</li><li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker.">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li><li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells.">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li><li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines.">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+gene+expression+in+HEK293+cells:+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis.">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li><li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells:+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency.">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li><li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers.">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li><li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+acid:+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures.">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li><li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility.">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li><li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate.">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Este protocolo detalha a transfecção, a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico em células HEK-293. A expressão estável de genes de anticorpo é o primeiro passo na geração de uma linha de células produtoras de anticorpo para o desenvolvimento e a fabricação de um anticorpo terapêutico. Enquanto ovário de hamster chinês (CHO) continuam a plataforma de escolha para proteínas terapêuticas expressão, a linha de células HEK-293 está a ganhar proeminência com a percepção de que...

O sucesso de anticorpos terapêuticos continua a impulsionar o investimento substancial no desenvolvimento de anticorpos como uma onda de terapêuticas próxima geração começa. O mercado de anticorpo deverá ser remodelada por fragmentos de anticorpos 1, conjugados de anticorpos droga-2, anticorpos biespecíficos 3 e anticorpos modificados com propriedades favoráveis 4. Outra classe ganhando interesse farmacêutico são biossimilares. anticorpos biossimilares são &quot;altamente semelhantes&quot; replicar produtos de um anticorpo terapêutico que já recebeu aprovação regulatória. A biossimilar proposto deve ser comparável com o anticorpo originador no que diz respeito à sua estrutura, função, toxicidade animal, a segurança clínica e eficácia, farmacocinética humana (PK), farmacodinâmica (PD) e imunogenicidade 5, 6. A aprovação rates de anticorpos biossimilares têm sido lentos devido às limitações estritas sobre a qualidade final do produto. Os processos de fabrico exactas, tais como linhas de células e condições de cultura específica através dos passos de processamento finais podem permanecer proprietária. O que é mais, a produção de anticorpos envolve inerentemente um grau de variabilidade que pode adicionar ao desafio de produzir um produto altamente semelhantes. A caracterização e comparação físico-química e biofísica abrangente é bastante difícil, mas uma série de estudos que demonstram as características dos anticorpos biossimilares estão surgindo na literatura 7, 8, 9. Geração de um anticorpo terapêutico começa com a transfecção de células hospedeiras de mamífero com um vector portador de genes para o respectivo anticorpo. projeto do vetor, as condições da linha celular e cultura são aspectos fundamentais para configurar o exsistema de pressão. As sequências de DNA de anticorpos podem ser provenientes de Drogas Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) ou publicações de pesquisa, incluindo patentes. Por exemplo, a sequência de trastuzumab está disponível através da droga Bank (DB ID: DB00072). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis ​​podem ser submetidos a concepção do gene e a optimização para a síntese nas espécies hospedeiras desejadas. É importante para um anticorpo biológico similar que nenhuma modificação é feita com a sequência de aminoácidos. Uma vez sintetizados, os genes de anticorpo pode ser subclonado no vector apropriado de escolha. anticorpos IgG humana consistem de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. Expressão fortemente regulada de ambas as cadeias é essencial para a produção óptima de proteína IgG heterólogo em células de mamífero 10. Intra-, bem como ligações dissulfureto inter-cadeias tem que ser formado e uma série de modificações pós-tradução tem que estar emtroduced durante a biossíntese da proteína. Uma série de vectores estão disponíveis, que foram especificamente concebidos para expressar genes de anticorpos (consultar a Tabela de Materiais). Estes vectores específicos de anticorpos normalmente expressam as regiões constantes para ambas as cadeias pesada e leve de modo que apenas as regiões variáveis ​​de cada cadeia requerem clonagem. A transfecção de células com duas construções independentes (co-transfecção), é a abordagem mais comum para a libertação de genes pesada e leve que codifica cadeia. Isto é, cada gene é conduzido pelo seu próprio promotor e transcrito como cadeias de anticorpo separadas antes de serem montadas no retículo endoplasmático. Por outro lado, os vectores multi-cistrónico têm elementos internos local de entrada de ribossoma (IRES) incorporados que permitem a expressão de múltiplos genes como um único transcrito de ARNm com tradução permitida a partir de regiões internas do ARNm 11. Neste exemplo, as pesadas e leves genes codificadores da cadeia são acoplados numa Arrangement para conseguir a co-expressão de ambas as cadeias de anticorpos 10, 12. Enquanto as células transfectadas transientemente produzir proteína suficiente para executar um número limitado de experiências, as linhas celulares transfectadas de forma estável que tenham sido submetidos a selecção para a integração do genoma pode proporcionar rendimentos mais elevados. Quantidades de proteína mais elevado para permitir que o desenvolvimento do ensaio, relativa a caracterização in vitro e pode proporcionar uma indicação da qualidade de anticorpos em consideração para aplicações a jusante, tais como a linha celular clonal e selecção de candidatos de chumbo. O objetivo deste artigo é descrever a expressão estável e a purificação de um anticorpo terapêutico produzido num sistema de expressão de mamífero. Com efeito, este método pode ser aplicado para a expressão de um anticorpo biológico similar. O método pode ser utilizado para a caracterização inicial de anticorpos, antes de prosseguir para o crítico, embora ste demoradops de identificar um clone desejável para o fabrico de maior escala. Além disso, este método pode ser utilizado para expressar proteínas e outros não apenas anticorpos. O protocolo detalhado seguinte descreve a expressão do anticorpo trastuzumab terapêutica. Esta consiste na preparação de DNA do vector seguido por transfecção estável na linha celular HEK-293 e a purificação da proteína do anticorpo por um método de cromatografia automatizado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1730">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:348px;">pFUSE vector series</td>
			<td style="width:189px;">N/A</td>
			<td style="width:191px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:1003px;">Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAbXpress vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td>
			<td>Heavy and light antibody genes expressed in separate vectors that require co-transfection. Refer to: Jones, M. L. et al. A method for rapid, ligation-independent reformatting of recombinant monoclonal antibodies. J Immunol Methods. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1 vector</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Heavy and light antibody genes are each driven by a separate promoter in a single vector.&#160; Refer to: Dodev, T. S. et al. A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GS vector series</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 1</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Li, J. et al. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies. J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-cistronic vector series 2</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multi-cistronic vector with heavy and light antibody genes co-expressed and translated as single transcript. Refer to: Ho, S. C. et al. IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954;</td>
			<td>61883</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Mammalian expression vector containing trastuzumab antibody genes with hygromycin resistance gene; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&#954; was a gift from Andrew Beavil.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro Agar</td>
			<td>fas-hg-s</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt LB agar containing 75 &#181;g/ml hygromycin.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fast-Media Hygro TB</td>
			<td>fas-hg-l</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td>Used to prepare low salt TB broth containing 75 &#181;g/ml hygromycin.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol, BioXtra, &#8805;99%</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Prepare to 80% with water and autoclave. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>G221020</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td>Plasmid Maxi Prep Kit; elute or resuspend DNA in water (pH 7.0-8.5).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293-F Cells</td>
			<td>R790-07</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>HEK-293 cell line adapted to suspension culture in serum-free media.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FreeStyle 293 Expression Medium</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Serum-free media specially formulated for maintaing 293-F cell line and high protein expression.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Kolliphor P188</td>
			<td>K4894</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Non-ionic surfactant; pluronic F-68; prepare to 10% in water and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM, high glucose&#160;</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat-Inactivated Foetal Bovine Serum</td>
			<td>10082-147</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:348px;">Polyethylenimine, Linear, MW 25,000&#160;</td>
			<td>23966</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>Prepare to 1 mg/ml in water. Adjust to pH 7.0 with 1 M HCl (solution becomes clear) and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at -80oC until use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiPro SFM</td>
			<td>12309-050</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Transfection formulated serum-free media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hygromycin B Solution</td>
			<td>ant-hg-1</td>
			<td>Jomar Life Research</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dimethylsulphoxide (DMSO)</td>
			<td>AJA2225</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tryptone (casein peptone)</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Prepare to 20% in PBS and filter-sterilize using 0.22 &#956;m filter. Store at 4oC.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4, 100 ml</td>
			<td>09-2051-100</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml column</td>
			<td>GE17-0403-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AKTApurifier 100</td>
			<td>28406266</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Automated FPLC system, which can include a P-960 sample pump and Frac-920 fraction collector.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine-HCl</td>
			<td>G2879</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citric Acid, monohydrate</td>
			<td>BIOC2123</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Citrate, trisodium salt dihydrate&#160;</td>
			<td>BIOCB0035</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 M Tris-HCl solution pH 9.0</td>
			<td>BIOSD8146</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal Filters (30 MWCO)</td>
			<td>UFC803008/UFC903008</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>Used to buffer exchange and concentrate purified protein.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Assay Kit</td>
			<td>23227</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BLItz System</td>
			<td>45-5000</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td>Instrument used for bio-layer interferometry (BLI) measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protein A biosensors</td>
			<td>18-5010</td>
			<td>fort&#233;BIO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylamide/Bisacrylamide (37.5:1), 40% solution</td>
			<td>786-502</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium Persulfate (APS)</td>
			<td>AM0486</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TEMED</td>
			<td>AM0761</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>786-498</td>
			<td>Astral Scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Precision Plus Dual-Color Protein Standard</td>
			<td>1610374</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory scale production and purification of a therapeutic antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

Produção estável de trastuzumab por células HEK-293 transfectadas foi confirmada utilizando interferometria-camada de bio (BLI), como apresentado na Figura 1. Uma curva padrão de IgG foi gerado através da medição da taxa de ligação entre um padrão de anticorpos IgG e proteína A biossensor (Figura 1A). A amostra de sobrenadante em bruto foi medida de modo análogo, em seguida, a sua concentração interpolada a partir da curva padrão ...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody at JoVE.com

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade.

Produção à escala laboratorial e purificação de um anticorpo terapêutico

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

17.2K visualizações.  University of Sydney.  Este protocolo descreve a produção de um anticorpo terapêutico num sistema de expressão de mamífero. Os métodos descritos incluem a preparação de ADN do vector, transfecção estável e adaptação isento de soro de uma linha celular de rim embrionário humano 293, configurado de culturas em larga escala e a purificação utilizando cromatografia de afinidade. 

Vídeo: Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Método para dobrar eficiente e purificação do Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to possess medicinally relevant biological activity. However, thus far this potential has not translated into a plethora of triterpene-derived drugs in the clinic. This is arguably (at least partially) a consequence of limited practical synthetic access to this class of compound, a problem that can stifle the exploration of structure-activity relationships and development of lead candidates by traditional medicinal chemistry workflows. Despite their immense diversity, triterpenes are all derived from a single linear precursor, 2,3-oxidosqualene. Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in N. benthamiana can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products that are not naturally produced by this host. Agro-infiltration is an efficient and simple means of achieving transient expression in N. benthamiana. The process involves infiltration of plant leaves with a suspension of Agrobacterium tumefaciens carrying the expression construct(s) of interest. Co-infiltration of an additional A. tumefaciens strain carrying an expression construct encoding an enzyme that boosts precursor supply significantly increases yields. After a period of five days, the infiltrated leaf material can be harvested and processed to extract and isolate the resulting triterpene product(s). This is a process that is linearly and reliably scalable, simply by increasing the number of plants used in the experiment. Herein is described a protocol for rapid preparative-scale production of triterpenes utilizing this plant-based platform. The protocol utilizes an easily replicable vacuum infiltration apparatus, which allows the simultaneous infiltration of up to four plants, enabling batch-wise infiltration of hundreds of plants in a short period of time.

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient heterologous expression of biosynthetic enzymes in Nicotiana benthamiana leaves can divert endogenous supplies of 2,3-oxidosqualene towards the production of new high-value triterpene products. Herein is described a detailed protocol for rapid (5 days) preparative-scale production of triterpenes and analogs utilizing this powerful plant-based platform.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...