O objetivo geral deste artigo é padronizar o protocolo para o isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco cardíacas, CSCs do Coração de Rato Adulto. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave, no campo das doenças cardiovasculares e terapia regional, como a terapia de células-tronco cardíacas e a insuficiência cardíaca. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rentável, com alto auxílio em pequeno período de tempo.
Inicie este experimento preparando todos os materiais, instrumentos e tampões de isolamento necessários em uma condição esterilizada, conforme descrito no protocolo. Depois de remover a pele do abdômen de um rato eutanizado, corte a caixa torácica dentro da coifa estéril para abrir a cavidade torácica. Exponha o coração e remova o sangue perto do coração usando uma seringa de um mililitro.
Para remover qualquer sangue perto do coração, lave a área circundante com PBS gelado. Usando tesouras cirúrgicas e pinças para dissecar o coração, coloque-o em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 mililitros de PBS gelado. Use fórceps curvas para palpitar o coração e remover o sangue residual dentro do coração.
Transfira de quatro a cinco corações isolados para uma placa petri de 100 mililitros contendo 10 mililitros de solução de sal balanceado do presunto gelado. Palpa os corações novamente para lavá-los e remover qualquer sangue residual dentro do coração. Para garantir a remoção completa do sangue, altere a solução HBSS após cada lavagem.
Segure cada coração com um par de fórceps e use uma lâmina cirúrgica para cortar cada coração em pedaços de dois a quatro milímetros em uma placa de Petri de 100 milímetros, contendo cinco a sete mililitros de HBSS. Altere frequentemente a solução para garantir a remoção completa do sangue. Finalmente, pique os corações na solução HBSS.
Centrifugar os corações picados colocados em um tubo cônico de 50 mililitros a 500 vezes G, a quatro graus Celsius por cinco minutos, e depois descartar o sobrenante. Adicione cinco a seis mililitros, 0,2% Solução de Colagenase II à pelota para digerir o tecido. Suspenda completamente a pelota balançando o tubo em um agitador a 75 vezes G, a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.
A cada 20 a 30 minutos, aperte o tubo vigorosamente à mão para melhorar a lise. Triturar a mistura de tecido lículo usando cinco mililitros pipeta sorológica, e uma ponta de pipeta de um mililitro para dissociar o nódulo tecidual na suspensão celular única. Para parar a lise enzimática do tecido, adicione duas a três vezes mais médio de manutenção CSC disponível comercialmente do que o volume do tecido líscido.
Passe a suspensão celular digerida através de um coador de células de 100 micrômetros colocado em um tubo cônico de 50 mililitros para remover quaisquer pedaços de tecido não digeridos. Para separar as células à centrifugação gradiente de densidade, adicione 37 graus Celsius, pré-aquecido, polisucrose e solução de diatrizoato de sódio a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione suavemente e lentamente um volume igual de filtrado sobre a solução, evitando qualquer mistura das duas soluções.
É fundamental adicionar filtrado sobre polisucrose e solução de diatrizoato de sódio lentamente sem misturar inclinando o tubo a 45 graus e contra a parede do tubo. Não adicione polisucrose e solução de diatrizoato de sódio sobre filtrado. Coloque o tubo muito lentamente em uma centrífuga de balde de balanço certificando-se de não perturbar as soluções.
Centrifugar a 500 vezes G por 20 minutos em temperatura ambiente fixada em uma velocidade de aceleração e desaceleração mais baixa para evitar misturar as duas soluções, e para a separação adequada das células-tronco cardíacas. É fundamental colocar a solução gradiente com muito cuidado sem perturbação na centrífuga. Colocar a aceleração e desaceleração da centrífuga deve ser de menor velocidade, como um ou zero.
Use uma pipeta de um milímetro para transferir o revestimento buffy contendo os CSCs, juntamente com uma solução extra da camada superior para um tubo esterilizado de 15 mililitros. Adicione um volume igual de meio de manutenção CSC e misture-o adequadamente para neutralizar a solução de polisucrose residual e diatrizoato de sódio. Centrifugar esta suspensão a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernaspeso. Repita a lavagem de CSCs com solução DMEM incompleta pelo menos por duas vezes. Centrifugar a 500 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius para se livrar de qualquer solução residual de polisucrose e diatrizoato de sódio.
Depois de remover o supernascimento, resuspenque a pelota contendo CSCs purificados em um meio de manutenção CSC mililitro e, em seguida, conte as células. Semente os CSCs em uma placa de cultura de seis poços revestida com uma solução de gelatina de 0,02% contendo 0,5% de fibronectina, e adicione dois mililitros de meio de manutenção completa. Cresça as células a 37 graus Celsius em 5% de CO2.
Quando a cultura CSC atingir a confluência, transfira as células para uma nova placa revestida de gelatina e fibronectina, conforme descrito no protocolo de texto. Cultura estes transferiram CSCs P0 em meio completo de manutenção CSC a 37 graus Celsius em uma incubadora de CO2 de 5% até confluente. Repita a transferência de células para uma nova placa para fazer CSCs P1 que podem ser usados para outros experimentos.
Para manter a cultura CSC em seu estágio inicial, semeou ainda mais as células conforme descrito no protocolo de texto. Para caracterizar as células cultivadas, coloque o CSC contendo placa no objetivo de um microscópio fluorescente. Use dez vezes a ampliação para concentrar as células.
Para observar as células, use abertura de contraste de fase e aumente a ampliação para 20 vezes alterando a lente objetiva e, em seguida, imagem dos CSCs. Depois de realizar a imunostaining, coloque a placa de cultura sob o microscópio de fluorescência. Concentre as células em diferentes ampliações, e observe as células sob contraste de fase e diferentes filtros de excitação, e salve as imagens.
Para diferenciação celular, cresça os CSCs em uma placa de seis poços com dois mililitros de 37 graus Celsius, meio de manutenção CSC pré-aquecido. Quando as células atingirem 80 a 95% de confluência, substitua o meio de manutenção por dois mililitros, 37 graus Celsius, meio de diferenciação de cardiomiócitos pré-aquecidos. Incubar a 37 graus Celsius, em um CO2 de 5% por até duas a três semanas.
Mude o meio de diferenciação a cada dois ou três dias. Durante a mudança média, observe a morfologia celular sob um microscópio para garantir as boas condições de cultura. Após 12 dias, imagem as células para marcadores de diferenciação seguindo um protocolo padrão de imunossuagem.
CSCs cultivados de dois a três dias mostram uma morfologia em forma de fuso quando observada sob um microscópio de contraste de fase. Após sete dias de cultura, eles mostram uma mudança na morfologia se alongando. Depois de imunosmunficar para marcadores de pluripotência, CSCs mostram expressões de OCT4, SOX2 e Nanog.
Além disso, os CSCs proliferam em meio de cultura e expressam o marcador de proliferação Ki67. Para caracterizar a origem cardíaca dos CSCs, foram examinadas expressões de marcadores cardíacos, e as células mostraram positivo para marcadores cardíacos Sca-1, NKX2.5 e GATA4. Após a culminação em meio de diferenciação de cardiomiócitos por 12 dias, CSCs diferenciados mostram expressão dos marcadores cardiomiócitos ACTININ e TROPONIN-I.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de não permitir a mistura da solução gradiente e do filtrado. Também é importante definir a aceleração e desaceleração em menor velocidade. Quem os contamina, é recomendável realizar todo o processo de isolamento celular dentro de um armário de biossegurança.
Após esse procedimento, outros métodos como a separação baseada em contas magnéticas ou métodos de classificação celular baseadas em citomóticos de fluxo podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, quão clara é a população homogênea das células-tronco cardíacas? O raio de crack em uma célula-tronco cardíaca é grande marcador, e há diferenças em relação aos cardiomiócitos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abrirá caminho para os pesquisadores do campo de doenças cardiovasculares que muitas vezes têm alto rendimento de células-tronco cardíacas do coração do camundongo, o que pode ser importante para a terapia regenerativa na insuficiência cardíaca isquêmica.
Não se esqueça que trabalhar com lâmina cirúrgica, alvejante e DMSO pode ser perigoso, e precauções como o uso de Equipamentos de Proteção pessoal, EPI, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
