Nosso sistema único de entrega de drogas, que usa partículas de ouro de 20 nanômetros em dois peptídeos curtos específicos, pode estabilizar nanopartículas de ouro em solução fisiológica e melhorar sua absorção celular, e assim, efetivamente fornecer peptídeos ou outras drogas em células. Nosso híbrido de peptídeo GNP é fácil de sintetizar e estável. Usando o híbrido de peptídeo de nanopartículas de ouro como portadores de drogas, podemos transferir drogas de peptídeos para as células de forma eficaz e em abundância.
Tratamos a lesão isquemia-reperfusão nos pulmões com nosso híbrido GNP/PKCi. O GNP traz peptídeos inibidores PKC para o citoplasma. Este método de entrega foi capaz de reduzir lesões pulmonares mais graves usando uma dose menor de PKCi do que outros métodos de entrega.
Para iniciar este procedimento, recupere os peptídeos de um congelador a menos 20 graus Celsius, e descongele-os à temperatura ambiente. Use uma micro escala para pesar 0,01 gramas de cada peptídeo descongelado e transfira cada peptídeo para um tubo cônico separado de 50 mililitros. Adicione 18,74 mililitros de água deionizada ao tubo P2 e 16,93 mililitros de água deionizada ao tubo P4.
Adicione 8,21 mililitros de 50% de acetonitrila diluídos em água deionizada ao tubo inibidor do delta PKC. Vórtice as soluções de peptídeos brevemente. Em seguida, coloque os tubos em um sonicator a 40 mega-hertz por cinco minutos.
Depois disso, transfira as soluções para um armário de biossegurança. É fundamental colocar o tubo cônico de 50 mL em um sonicator por cinco minutos. Se esta etapa for ignorada, o GNP/PKCi formará agregações.
Transfira um mililitro de cada solução de peptídeo para seu novo tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 19 mililitros de água deionizada aos tubos contendo P2 e P4. E adicione 19 mililitros de 50% de acetonitrila ao tubo contendo inibidor delta PKC. Adicione 475 mililitros da solução P2, 25 microliters da solução P4, 500 microliters da solução inibidora delta PKC a um tubo de 15 mililitros.
Em seguida, adicione nove mililitros de uma solução GNP de 20 nanômetros ao mesmo tubo. Remova a solução combinada do armário de biossegurança e enrole o tubo em papel alumínio. Coloque o tubo em um agitador durante a noite.
No dia seguinte, devolva as amostras ao armário de biossegurança. Transfira uma alíquota mililitro da solução GNP/PKCi em micro tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os micro tubos a uma micro centrífuga a 15294 vezes g e a quatro graus Celsius por 30 minutos.
Transfira os micro tubos de volta para o armário de biossegurança e remova o supernêgente de cada tubo, garantindo que a pelota GNP não seja perturbada. Resuspenda cada pelota no solvente desejado de acordo com a concentração necessária. Para avaliar a solubilidade híbrida GNP/PKCi, despeje 0,5 mililitros da solução GNP/PKCi em um cuvette de acréscimo.
Coloque o cuvette em um espectrômetro UV-Vis e teste o pico de absorção. Neste estudo, o inibidor de proteína quinase C-delta é conjugado com nanopartículas de ouro para formar um híbrido GNP/PKCi. Deve-se tomar cuidado com a avaliação das propriedades biofísicas do híbrido, pois as nanopartículas de ouro tendem a se agregar em um solvente.
Quando as nanopartículas se agregam, a cor da solução mudará de rosa para roxo. As amostras são analisadas com um espectrofotômetro UV-Vis que é capaz de detectar com alto grau de sensibilidade. Se o híbrido não for agregado, o pico de uma absorção deve ser de 525 nanômetros.
Se o PIB for agregado, o pico de absorção será deslocado para a direita. Como se pode ver, quando os agregados se formaram, a densidade óptica delta diminui. Ao formular os híbridos de peptídeos GNP, é importante lembrar que a proporção de peptídeos para a solução GNP deve ser de um a nove.
Esta fórmula GNP/PKCi pode ser usada para lesão de reperfusão de isquemia em sistemas de órgãos diferentes do pulmão. Qualquer peptídeo pode se ligar ao PIB se esses peptídeos tiverem um resíduo de cisteína no N-terminus. Isso significa que o híbrido de peptídeo GNP pode ser usado para transportar outras drogas de peptídeos para a célula.
Peptídeos criados racionalmente são uma nova tecnologia que pode trazer interação proteína-proteína específica dentro dessas células. Esta técnica, desenvolvida aqui, pode ser usada para a entrega de novos medicamentos peptídeos ou para versões modificadas de medicamentos existentes.
