Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de entrega de medicamentos, como a entrega direcionada de terapêuticas a cânceres humanos e o cistoblasto da placenta. A principal vantagem dessa técnica é que é um método simples e reprodutível para sintetizar peptídeos conjugados em outras partículas. Para começar, adicione três milímetros de 4% de etanol a um tubo de centrífuga de 10 mililitros estéril.
Em seguida, adicione 90 microgramas de solução de estoque de lecitina de soja, 210 microgramas de solução de estoque de ácido DSPE-PEG-carboxílica e 750 microgramas de solução de estoque DOX. Use uma seringa de um mililitro para pipetar dois miligramas de solução de estoque PLGA. Coloque o tubo de centrífuga em um banho de gelo em um processador ultrassônico e sonicate por dois minutos.
Em seguida, adicione a solução de estoque PLGA em termos de gota no tubo centrífuga. Para purificar os DNPs, use um filtro de centrífuga para lavar a solução em 0,1 amortecedor MES molar. Em seguida, centrifugar a solução a 1000 G por três minutos a quatro graus Celsius.
Para iniciar a ativação do éster, adicione 0,4 miligramas de EDC a um mililitro de DNPs. Em seguida, adicione 0,24 miligramas de NHS à reação. Em seguida, permita que a reação ocorra por até uma hora à temperatura ambiente no escuro.
Depois disso, misture bem os componentes de reação e coloque a reação em um agitador. Para iniciar a reação de amina, use PBS para aumentar o pH tampão de 7,2 para 7,5. Em seguida, adicione 0,5 miligramas de peptídeo de mira pICSA à solução de reação.
Misture bem a solução e coloque-a em um shaker. Então, permita que a reação prossiga a quatro graus Celsius durante a noite no escuro. No dia seguinte, encha sacos de diálise com a solução conjugada.
Purifique os DNPs pICSA com tampão PBS à temperatura ambiente por 24 horas no escuro. Depois de esculpir células de acordo com o protocolo de texto, remova a mídia e adicione um mililitro de mídia fresca e fria com 5% de FBS e DNPs pICSA ou DNPs. Em seguida, incubar a célula e a mistura de nanopartículas por uma hora a quatro graus Celsius.
Depois disso, remova a mídia e lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione um mililitro de mídia fresca e incuba as células por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois disso, remova a mídia e lave as células três vezes com PBS.
Em seguida, adicione dois mililitros de frio, 4% PFA e incubar a mistura à temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o PFA e lave as células com dois mililitros de PBS. Em seguida, adicione um mililitro de PBS com DAPI para coloração de núcleos.
Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente por 10 minutos. Por fim, adicione o meio de montagem e a imagem da fluorescência com um microscópio de fluorescência. Utilizando este protocolo, os DNPs foram preparados com sucesso e conjugados para pICSA BP. Após a conjugação, o diâmetro dos DNPs primários aumentou para aproximadamente 109 nanômetros.
As imagens TEM dos DNPs e dos DNPs pICSA mostraram que as partículas estavam bem dispersas e geralmente demonstravam morfologia esférica. O potencial zeta das nanopartículas foi negativo 20,1 e 29,9 milivolts, indicando que as nanopartículas eram altamente estáveis. O ensaio de captação celular JEG3 indicou os DNPs pICSA ligados às células JEG3 dentro de 30 minutos.
Portanto, a pICSA BP foi eficientemente conjugada à superfície. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sonicar a mistura por um a dois minutos antes de adicionar PLGA. Após este procedimento, nossos métodos como o ensaio HPLC podem ser realizados a fim de determinar a eficiência da conjugação com mais precisão.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia reprodutiva explorarem a possibilidade de tratamento direcionado à placenta em complicações da gravidez.
