O método de autoindução sem células reduz a supervisão dos pesquisadores e o tempo necessário para produzir extratos funcionais de células. Isso simplifica protocolos anteriores de síntese de proteínas in vitro que eram mais demorados e intensivos. Essa técnica é menos complicada e também de alto rendimento, o que permitirá que um público maior implemente a livre expressão celular.
Este método destaca a importância do metabolismo energético durante o crescimento celular e dentro de reações livres de células. Comece preparando 960 mililitros de mídia de autoindução sem células. Em seguida, esterilize a mídia em um frasco perplexo de 2,5 litros por autoclaving por 30 minutos a 121 graus Celsius.
Em seguida, depois de preparar 40 mililitros da solução de açúcar, esterilize-o em um recipiente de vidro autoclavado separado. Após o autoclaving, quando a mídia cultural esfriar para abaixo de 40 graus Celsius, adicione a solução de açúcar esterilizada diretamente à mídia. Em seguida, inocular a mídia deslizando um loop cheio de colônias de uma placa estelar E.coli BL21 anteriormente listrada e inserindo o loop diretamente na mídia.
Gire o laço na mídia sem tocar nas laterais do recipiente. Em seguida, coloque a mídia inoculada durante a noite em uma incubadora de 30 graus Celsius com agitação a 200 RPM. No dia seguinte, colde as células transferindo um litro da mídia em uma garrafa de centrífuga de um litro e centrifugando a 5.000 vezes G entre quatro e 10 graus Celsius por 10 minutos.
Depois de descartar o supernatante, use uma espátula estéril para transferir a pelota para um tubo cônico pré-refrigerado e anteriormente pesado de 50 mililitros. Em seguida, lave a pelota uma vez com 30 a 40 mililitros de tampão S30 frio, reutilizando a pelota através de vórtice em rajadas de 30 segundos com períodos de descanso no gelo. Depois que a pelota estiver completamente ressuspendida, centrifugar a ressupensão celular, descartar o supernasal e usar um tecido limpo, limpe qualquer excesso de sobrenante das paredes internas do tubo de 50 mililitros sem tocar na pelota.
Em seguida, pese a pelota antes de piscar congelando-a em nitrogênio líquido e armazene-a a menos 80 graus Celsius até usar mais. Para preparar o extrato celular, adicione um mililitro de tampão S30 por grama da pelota de célula congelada e deixe a pelota descongelar no gelo por 30 a 60 minutos. Em seguida, resuspenda a pelota descongelada através de vórtice em rajadas de 30 segundos com períodos de descanso no gelo até que não permaneçam aglomerados de células visíveis.
Para lise celular, transfira 1,4 mililitros da suspensão celular para tubos de microfuge de 1,5 mililitro. Em seguida, sonicar a suspensão celular em cada tubo com uma frequência de 20 kilohertz e 50% de amplitude para três rajadas de 45 segundos com 59 segundos de descanso por ciclo em um banho de gelo Inverter o tubo entre os ciclos, e após o último ciclo de sonicação, adicione imediatamente 4,5 microliters de um molar dithiothreitol. Depois de sonicar a suspensão celular em todos os tubos, centrifugar os tubos e coletar o supernatante em alíquotas de 600 microliter em tubos frescos de microfuça de 1,5 mililitro.
Flash congele e armazene as alíquotas a menos 80 graus Celsius até que use mais. Para realizar 15 microlitres de reação de síntese de proteínas livres de células em tubos de microfuge de 1,5 mililitros em quadruplicato, descongele uma alíquota do extrato celular. Depois de preparar cada mistura de reação de 15 microliter, permita que a reação se escorra por pelo menos quatro horas a 37 graus Celsius.
Para quantificar a proteína repórter, combine 48 microliters de 50 mililitros de tampão HEPES de 50 mililitros no pH 7.2 com dois microliters de cada produto de reação de proteína livre de células em uma placa de poliestireno preto 96-well. Quantifique a intensidade de fluorescência da proteína fluorescente verde superpatos, ou sfGFP, usando um comprimento de onda de excitação de 485 e comprimento de onda de emissão de 528 nanômetros. Em seguida, converta as unidades relativas de fluorescência para o rendimento volumoso do sfGFP criando uma curva padrão usando plasmídeo pJL1 sfGFP purificado.
Aqui são mostradas pelotas de mídia de autoindução sem células após a colheita celular em diferentes densidades ópticas medidas a 600 nanômetros. A mídia cresceu para uma densidade óptica de 10 produziu uma quantidade maior de pelotas de células no extrato global do que a mídia cultivada a uma densidade óptica de 2,5. Uma análise mais aprofundada da concentração total de proteínas não demonstrou diferença significativa na proteína global entre ambos os extratos.
Embora a mídia tenha sido cultivada para diferentes níveis de densidade óptica, ambos os extratos demonstraram resultados semelhantes em reações livres de células expressando sfGFP. Manter condições estéreis enquanto prepara a solução de mídia e açúcar é importante. Este método de extração celular CFAI pode ser usado para a maioria das aplicações de expressão livre de células.
Estes vão desde a educação em biotecnologia até a engenharia de proteínas, bem como diagnósticos de ponto de cuidado. Este método reduz a quantidade de tempo e habilidade técnica necessária, melhora a reprodutibilidade e produz maiores quantidades de extrato.
