Este protocolo é o primeiro a introduzir a tecnologia de digitalização 3D no campo de pesquisa anatômica, especificamente neuroanatomical, e tem alcançado um desempenho altamente preciso sobreposto. A neuro 3D incorporando sobreposição, ou protocolo neuro 3D, incorpora tomadas estéreis em microescamas em imagens cerebrais em macroesponíveis, e conecta essas diferentes escalas espaciais perfeitamente. Também temos que aplicar o protocolo neuro 3D às ressonâncias magnéticas humanas e ao cérebro pós-morte.
A sobreposição nos permite identificar padrões conhecidos de contraste de ressonância magnética relacionados à doença. Os sistemas de varredura 3D são sensíveis à água ao redor do biorganismo extraído, por isso é fundamental limpar a água com muito cuidado. Além disso, o procedimento deve ser realizado o mais rápido possível.
Inicie este procedimento com a preparação de um mouse, bem como aquisições de ressonância magnética e preparações de equipamentos conforme descrito no protocolo de texto. No segundo dia, corte o couro cabeludo de um rato previamente eutanizado ao longo da sutura sagital usando uma tesoura cirúrgica. Use uma tesoura cirúrgica para cortar o crânio em direções diagonais do ponto lambda a um ponto um pouco na frente do bregma.
Em seguida, retire suavemente o crânio do cérebro usando pinças curvas. Levante o cérebro com uma espátula e transfira-o para uma placa de Petri com solução de corte gelado. Usando uma bomba de gás externa com uma velocidade de bomba rotativa controlada, fluir ar contendo 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono para gerar pequenas bolhas na solução de corte gelado.
Depois de um a dois minutos, coloque o cérebro em um pano de microfibra cuja superfície é ligeiramente coberta por uma peneira de farinha. Limpe suavemente o fluido da superfície cerebral usando o pano de microfibra. Coloque o cérebro, com seu aspecto dorsal para cima, no suporte da amostra.
Em seguida, coloque o suporte amostral no centro do toca-discos automático. Escureça a sala durante a varredura 3D e realize uma varredura 3D no toca-discos. Para testar se a varredura 3D funciona bem, clique em Digitalizar 3D selecionando o ângulo entre duas tomadas como 22,5, o ângulo de partida como zero e o ângulo final como 360.
Mova o cérebro para uma placa de Petri e borbulhe o cérebro na solução de corte por aproximadamente 10 segundos. Corte o cérebro em dois blocos no meio do plano coronal, usando um bisturi. Em seguida, mova os dois blocos cerebrais suavemente para a superfície plana usando uma espátula cirúrgica.
Anexar os blocos cerebrais da base do bloco cerebral usando cola instantânea. Limpe suavemente e cuidadosamente o fluido da superfície cerebral dentro de um a dois minutos, usando o pano de microfibra. Em seguida, faça uma varredura 3D novamente.
Coloque uma lâmina no suporte da lâmina do vibratome. Conecte a fita preta cobrindo o centro da base do bloco cerebral ao centro do estágio de corte para um vibratome. Despeje a solução de corte na fase de corte e coloque o estágio de corte no vibratome.
Ajuste a velocidade de corte e a amplitude. Faça de duas a cinco fatias coronais de 300 mícrons de espessura dos dois blocos cerebrais. Mantenha a solução na fase de corte borbulhando, se possível.
Otimize a velocidade de corte, a frequência e a amplitude de vibração do sistema, definindo-os como 12,7 milímetros por minuto para a velocidade, 87 a 88 hertz para a frequência e 0,8 a 1,0 milímetros para a largura do balanço. Ao cortar as fatias cerebrais, registo da coordenada fatiada no formato, incluindo a coordenada anterior-posterior, hemisfério e outras condições. Transfira suavemente as fatias cerebrais para um béquer cheio de ACSF pré-aquecido usando uma pipeta de plástico grossa.
Incubar as fatias cerebrais no béquer a aproximadamente 34 graus Celsius por uma hora. Durante este tempo, realize uma varredura 3D dos blocos cerebrais restantes no estágio de corte. Agora, defina uma matriz multieletrísda, ou chip MEA, em uma unidade de gravação.
Conecte o chip a uma bomba peristáltica usando dois tubos. Use um tubo para guiar o mesmo ACSF no chip MEA e o outro tubo para guiar o ACSF para fora do chip MEA. Anexar duas agulhas, conectadas nas pontas dos dois tubos, ao topo da parede do chip MEA.
Corrija suas posições com suas pontas seguindo a parede interna do chip MEA. Defina a taxa de fluxo do ACSF para 4,1 RPM. Realize o processamento de dados de ressonância magnética para extrair volumes corticais conforme descrito no protocolo de texto.
Para realizar o processamento de imagens de ressonância magnética, baixe o software livre 3D Slicer. Abra as imagens de MR dos cérebros extraídos que foram produzidos usando a renderização de volume e módulos de editor no Cortador 3D. Altere o modo de editor para renderização de volume, e clique em um botão de destino para fazer com que a imagem do cérebro chegue ao centro da tela.
Selecione o modo cérebro MRT-2 e sintonize os limiares movendo a barra de câmbio. Em seguida, mova-se de renderização de volume para editor e clique no botão de efeito limiar. Aplique o rótulo 41, córtex cerebral.
Em seguida, salve os dados da superfície cerebral como um arquivo STL alterando o formato de arquivo de VTK para STL na lista de verificação de formulário. Realize uma coregistração automática entre oito ou 16 imagens tiradas de oito ou 16 ângulos diferentes dentro de uma sequência de uma varredura para corrigir pequenos desencontros. Para isso, clique em Registro Global incluído na opção de alinhamento e integre as imagens.
Repita os scans de diferentes ângulos para obter toda a superfície cerebral. Se a integração entre imagens digitalizadas de diferentes ângulos não foi bem sucedida, clique em Alinhamento Manual e selecione um par de imagem fixa e uma imagem em movimento. Inicie o alinhamento manual das imagens selecionando três ou quatro pontos comuns em diferentes imagens.
Em seguida, clique em OK. O algoritmo de otimização é o algoritmo iterativo de ponto mais próximo e não inclui uma deformação não linear. Faça uma malha de todas as imagens alinhadas selecionando todas as imagens e clicando no botão de geração de malha. Em seguida, selecione a opção, pequeno objeto artístico, para obter a malha na mais alta resolução.
Salve a imagem como STL Binary ou um formato ASCII. Agora, abra a superfície de ressonância magnética e mescle-a com a superfície de varredura 3D usando o software de processamento de superfície. Realize um processo de alinhamento manual como antes.
Em seguida, salve essas imagens de superfície registradas novamente. Se necessário, limpe os dados da superfície individual apagando pequenos ruídos ao redor da região cerebral, especialmente no caso dos dados de ressonância magnética, e preenchendo quaisquer buracos, especialmente no caso dos dados de varredura 3D. Finalmente, abra os dados de superfície com softwares de análise de dados, como o MATLAB.
Gerar e avaliar os histogramas das distâncias mínimas entre as duas superfícies. As distâncias foram avaliadas entre superfícies corticais produzidas pela remoção do volume de ressonância magnética e superfícies obtidas a partir de escaneamentos 3D de cérebros extraídos. Os valores de modo do histograma das distâncias são de apenas 55 mícrons.
Além disso, ao acumular o histograma a partir do ponto em que a distância é igual a zero, o valor acumulado atinge 90% do número total da amostra em aproximadamente 300 mícrons. O histograma final das distâncias entre duas superfícies mostrou um pico típico em torno de 50 mícrons. Do ponto de vista macroscópico, esse valor de modo corresponde à limitação geométrica, que era de 100 mícrons do tamanho do voxel de MRIs.
Este ponto indiretamente sugere que o algoritmo sobreposto entre a ressonância magnética e a varredura 3D funcionou soberbamente bem, e que os níveis de ruído tanto da ressonância magnética quanto da varredura 3D foram suprimidos como um valor baixo. Este protocolo é o primeiro a se uprise através da tecnologia de varredura para biorganismo. A tecnologia foi originalmente utilizada para demandas puramente de engenharia.
Aplicar essa tecnologia à medicina pode responder a novas perguntas. Após a varredura 3D, podemos usar gravações de patch gram de parede de imagem de cálcio para obter conhecimento complementar em termos de resolução temporal e espacial e números graváveis de células. O desempenho altamente preciso que este protocolo fornece tornará uma associação perfeita entre a escala espacial anatômica e a escala espacial zero mais realista do que antes.
