O objetivo de nossa pesquisa é estudar a patogênese da esclerose múltipla. Para alcançar esse objetivo, estabelecemos um programa rápido de autópsia para obter e estudar os cérebros de indivíduos com ESM. Há dois aspectos especiais do nosso programa de autópsia, o primeiro é que é rápido. Coletamos o cérebro com menos de seis a oito horas de morte.
Isso permite estudos moleculares de última geração. O segundo aspecto é que fazemos uma ressonância magnética antes de movermos o cérebro. Isso nos permite correlacionar alterações patológicas com alterações de imagem cerebral.
A demonstração visual permite que os espectadores entendam como organizamos nosso espaço e tempo para alcançar resultados ideais. O processamento tecidual que acontece de forma rápida e cuidadosa permite a análise do RNA, imunosstaining, imunoblotting e ressonância magnética. Novos pesquisadores podem ter dificuldades com o processamento de tecidos com baixa integridade tecidual.
Evitar longos tempos de fixação pós-morte é importante e as estrias de cabos de ressonância magnética podem ser desafiadoras, por isso a consulta com especialistas em análise de ressonância magnética pode ser muito útil. Demonstrando o procedimento serão Emilie Christie e Christina Volsko. Técnicos do nosso laboratório.
Depois de in situ ressonância magnética, pese e fotografe o cérebro e coloque qualquer dura presa em um recipiente de 4%Paraformaldeído ou PFA. Separe o cerebelo e o tronco cerebral do cerebrum e fotografe o cerebrum. Use uma sonda para separar os nervos ópticos, quiasmo e tratos e ressectar a estrutura com um bisturi.
Separe os hemisférios cerebrais longitudinalmente e fotografe cada hemisfério individualmente. Tinta do córtex motor primário ou PMC para o hemisfério esquerdo, refotografar o tecido e colocar o tecido em um recipiente de 3,3 litros para fixação longa. Para extirir o PMC para o hemisfério direito remova os meninges de cobertura e refotografia do tecido.
Em seguida, ressecção do PMC usando um bisturi. Em seguida, fotografe o PMC ressecado ao lado do hemisfério. Corte o PMC em seis seções de tamanho igual e inseje o aspecto rostral de cada seção.
Em seguida, coloque todas as outras seções em recipientes preenchidos com PFA para fixação curta. E congele as seções restantes para armazenamento em sacos de congelador lacrados, no refrigerador número um. Corte o hemisfério direito anterior para posterior em seções coronais de um centímetro de espessura.
Corrija todas as outras seções em PFA e congele as seções restantes para armazenamento em sacos congeladores lacrados, no refrigerador número um. Separe o tronco cerebral do cerebelo e coloque o tronco cerebral em um recipiente preenchido com PFA para fixação curta. Corte cada hemisfério cerebelar em quatro seções sagiais igualmente fixas e fotografe as visões medial e lateral.
Em seguida, coloque as fatias hemisféricas cerebelares esquerdas em um recipiente de PFA para fixação curta. E congele as fatias hemisféricas cerebelares certas para armazenamento em sacos de congelador selados, no refrigerador número um. Depois de obter a medula espinhal com as raízes nervosas remova a medula espinhal dura mater e armazene a dura dura em PFA.
Separe as raízes nervosas anteriores e posteriores esquerdas e posteriores e corte as raízes nervosas anteriores e posteriores esquerdas da medula espinhal para fixação curta em PFA. Corte as raízes nervosas anteriores e posteriores direitas da corda espinhal e escorra congelar esses tecidos para armazenamento em sacos congeladores selados, no refrigerador número dois. Em seguida, fotografe o caudal-most 20 centímetro da medula espinhal e corte duas seções de transferência de centímetros da direção caudal para rostral do cordão para fixação curta pfa e congelamento de snap.
Em seguida, fotografe a porção rostral restante da medula espinhal. E corte duas seções de transferência de centímetros da direção caudal para rostral do cabo para fixação curta pfa e congelamento de snap. Corte seções de juros dos tecidos fixos curtos ou longos.
Coloque as seções em poços individuais de uma placa de seis poços e lave os tecidos com três lavagens de cinco minutos em dois mililitros de PBS fresco por lavagem, com agitação. Para recuperação de antígeno, micro-ondas as seções por dois a três minutos em um copo de vidro contendo cerca de 30 mililitros de 10 milimollars citrate buffer. Quando as seções tiverem esfriado para a temperatura ambiente transfira as amostras para uma nova placa de seis poços para três lavagens de cinco minutos e dois mililitros de PBS, mais 0,3% Triton X-100 por poço, por lavagem.
Seguido pelo bloqueio de peroxidase endógeno em dois mililitros de peróxido de hidrogênio de 3% mais 0,3% Triton X-100 em PBS por 30 minutos, à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as seções três vezes em dois mililitros de PBS mais Triton X-100 por lavagem, como demonstrado. Seguido pelo bloqueio em dois mililitros de soro de cabra 3% normal e PBS mais Triton X-100 por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, incubar as seções da noite para cinco dias nos anticorpos primários de interesse a quatro graus celsius seguidos por três lavagens de cinco minutos em dois mililitros de PBS por lavagem. Incubar as seções em solução complexa avidin-biotina ou complexo ABC por uma hora, em temperatura ambiente. Acompanhe isso com três lavagens de cinco minutos na PBS.
Rotule as seções com dois mililitros de Diaminobenzidina filtrada complementadas com per-per-per well de per per well de per-per for de três a oito minutos. Quando a cor tiver se desenvolvido adequadamente, lave as seções três vezes em PBS e transfira individualmente cada seção para um recipiente preenchido pbs. Posicione cada seção fixamente, sob lâminas de tecido individuais.
E levante suavemente cada slide para fora do PBS, mantendo as seções o mais planas possível. Use duas pincéis para achatar suavemente e esticar cada tecido. E use uma toalha de papel para afastar o excesso de água.
Em seguida, monte as seções com um meio de montagem adequado e sele cada deslizamento de tampa com esmalte claro. As seções teciduais são examinadas para a presença de lesões de matéria branca e as regiões selecionadas são manchadas para atividade imunológica e desmielinização. Em lesões múltiplas agudas, muitos desses axônios desmielinados atuam como lâmpadas de retração axonal que refletem as extremidades proximais dos axônios transeccionados.
A densidade de axônios transectados em lesões agudas excede 11000 por milímetro cúbico em lesões ativas, em comparação com apenas 15 em regiões adjacentes de matéria branca não lesiva. Oligodendrócitos recém-gerados também estão presentes em muitas lesões crônicas de ESM. Esses processos associam-se, mas não meliam axônios desmielinados.
Uma busca representativa e imparcial por alterações genéticas neuronais no córtex motor rapidamente congelado obtido de pacientes crônicos de ESM, identificou reduções significativas em 23 estudos de credenciamento do mensageiro mitocondrial nuclear e codificado por RNA usando imunocytoquímica e na hibridização in situ indicou que esses genes foram altamente enriquecidos em neurônios de projeção cortica e que mitocôndrias isoladas de axônios de projeção mostram glicolyse reduzida. A comparação da expressão genética do neuronodo no hipocampi mieliado e desmielinado revela reduções no mensageiro neuronal RNA's, incluindo proteínas envolvidas na memória e aprendizagem. Além disso, em comparação com os cortices de controle, a perda neuronal cortical é significativamente maior em uma subsuso populacional de pacientes com ES que têm desmielinização da medula espinhal e córtex cerebral, mas não da matéria branca cerebral.
Durante o processamento tecidual, certifique-se de que quando as seções coronais são cortadas elas são cortadas consistentemente em relação à espessura e orientação. E que eles ficam deitados quando flutuam em um fixador ou quando congelados. Além da análise imunohistoquímica, a coleta de tecidos congelados nos dá a oportunidade de realizar análises genéticas e proteômicas.
Estas técnicas têm auxiliado na identificação de uma nova coorte de pacientes com ES com lesões de matéria branca cerebral na ressonância magnética, mas sem qualquer demyelinação de matéria branca significativa. Denominado Mielócortical MS.
