Apresentamos um protocolo simples para visualização de glicoconjugados siallados intracelulares com alta resolução espacial, eliminando a necessidade de equipamentos especializados. Este método facilita o estudo da biossíntese, tráfico e reciclagem em vários contextos patológicos. Para conseguir isso, combinamos marcação metabólica, química de clique e microscopia de expansão.
Técnicas de microscopia de super-resolução como STED e STORM permitem que os cientistas ultrapassem a barreira da difração, mas exigem equipamentos caros. Recentemente, o microscópio de expansão surgiu como uma alternativa mais acessível que melhora a resolução ampliando fisicamente a amostra. Este método pode ser usado com qualquer microscópio de rotina de recursos completos.
Não requer microscópios de super resolução, que são caros, demorados, de difícil acesso e requerem otimização extensiva. Portanto, este método é facilmente transferível para a maioria dos laboratórios. Para começar, adicione um mililitro de meio suplementado com 500 micromolares de N-azidoacetilmanosamina às células preparadas e incube por 24 horas a 37 graus Celsius sob uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, lave as amostras com um mililitro de PBS. Usando 500 microlitros de paraformaldeído a 5%, fixe as células em cada lamínula e deixe-as descansar por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma câmara úmida personalizada usando uma caixa opaca com tampa.
Coloque um pedaço de papel mata-borrão úmido na parte inferior e, em seguida, coloque uma camada de parafilme por cima. Coloque as lamínulas no parafilme com as células voltadas para cima. Para permeabilização celular, adicione 200 microlitros de 0,5% Triton X-100 em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, lave as células três vezes com 200 microlitros de PBS. Prepare um tampão de reação CuAAC para rotular os glicanos sialilados modificados com azida projetados usando os componentes fornecidos. Para iniciar a reação, adicione 200 microlitros do tampão CuAAC a cada lamínula e cubra bem a amostra.
Em seguida, lave as lamínulas três vezes com 200 microlitros de PBS para interromper a reação e remover o excesso de sonda e reagentes. Incube as amostras por uma hora a quatro graus Celsius em 200 microlitros de tampão de bloqueio BSA. Adicione 70 microlitros da solução contendo o anticorpo primário às lamínulas e incube por uma hora a quatro graus Celsius protegido da luz.
Em seguida, adicione 100 microlitros do anticorpo secundário fluorescente a cada lamínula e incube por uma hora em temperatura ambiente protegida da luz. Depois de lavar as lamínulas três vezes com PBS, transfira as lamínulas para uma placa de seis poços e armazene as amostras em dois mililitros de PBS a quatro graus Celsius por alguns dias protegidas da luz. Para começar, incubar as células de imunocoloração com n-Acriloilsuccinimida a uma concentração de 3,2 miligramas por mililitro em PBS em um agitador mecânico por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, lave as amostras três vezes com um mililitro de PBS. Agora, coloque uma gota de 70 microlitros de solução de monômero em um pedaço de parafilme. Adicione 1,4 microlitros de 10% de N, N, N'N'Tetrametiletilenodiamina e 10% de persulfato de amônio e, em seguida, misture-os na gota.
Coloque rapidamente a lamínula sobre a solução com as células voltadas para baixo. Deixe a solução polimerizar por uma hora em temperatura ambiente em uma câmara úmida. Em seguida, adicione um mililitro de tampão de digestão ao hidrogel e deixe a digestão prosseguir por três horas a 37 graus Celsius em um agitador mecânico.
Depois de remover o tampão de digestão, lave o gel três vezes com dois mililitros de água deionizada. Agora, deixe o hidrogel se expandir em três mililitros de água deionizada por duas horas, trocando a água a cada 30 minutos. Para começar, ligue o microscópio e certifique-se de que as fontes de luz estejam aquecidas.
Em seguida, abra o Software de Aquisição de Bioimagem. Para criar os canais, selecione os comprimentos de onda de excitação do laser correspondentes aos fluoróforos e ative os lasers de acordo. Selecione uma objetiva apropriada, como uma objetiva de imersão em óleo de 63x com uma abertura numérica de 1,4 ou equivalente.
Agora, coloque e prenda uma lamínula de 32 milímetros de diâmetro em um suporte adaptado ao microscópio. Coloque a amostra de células de imunocoloração com as células voltadas para baixo na lamínula de 32 milímetros e adicione uma gota de água deionizada para evitar que a amostra seque. Em seguida, coloque o suporte com a lamínula no microscópio stage acima da objetiva.
Para imagens pós-expansão, coloque hidrogel na lamínula e execute uma varredura de ladrilhos. Use o modo Campo claro ou Fluorescência de baixa intensidade do laser para localizar uma área de interesse e focalizá-la. Em seguida, defina os parâmetros de aquisição de imagem, como velocidade de varredura, número médio, direção, modo de varredura, método e tamanho do orifício para obter a observação desejada.
Agora, visualize as células no software usando o modo Live Fluorescence. Aumente gradualmente a potência do laser e ajuste o ganho e o deslocamento do detector para amplificar o sinal sem introduzir ruído excessivo, garantindo uma visualização clara da fluorescência sem superexposição. Por fim, realize a aquisição da imagem e salve os dados no formato desejado, garantindo a inclusão de metadados adequados para referência futura.
Quando a aquisição estiver concluída, adicione uma pequena quantidade de água deionizada para facilitar a transferência usando uma pinça e transfira a amostra de volta para a placa de seis poços. O diâmetro médio do núcleo de Feret aumentou de 17,7 micrômetros antes da expansão para 70,3 micrômetros após a expansão, indicando um fator de expansão de quatro. O padrão de marcação de fibroblastos antes da microscopia de expansão mostrou fluorescência vermelha e verde proeminente indicando detalhes subcelulares no aparelho de Golgi, mas com resolução limitada, impedindo a análise na morte.
Após a microscopia de expansão, foi observada uma resolução espacial significativamente aprimorada das estruturas subcelulares com vesículas verdes e vermelhas mais intrincadas visíveis dentro das células dos fibroblastos.
