Nosso protocolo descreve como montar e caracterizar eletricamente um biomembrano dopado por peptídeos que imita de perto as propriedades de composição, estrutura e transporte de sinapses biológicas e que exibe resistência à memória incapaz. Essa técnica capacita os usuários a avaliar a dependência da atividade, a resistência à memória e a plasticidade de curto prazo em sistemas projetados em escalas de tempo e níveis de excitação relevantes para sinapses biológicas e canais de íons. Esta técnica fornece uma estrutura para caracterizar membranas biomiméticas contendo canais de íons ativados por tensão, tornando-a aplicável à caracterização de uma variedade de processos de transporte celular, incluindo os dos neurônios.
Nossa sugestão para novos pesquisadores é primeiro tornar-se proficiente na preparação de soluções lipossóicas e na montagem de uma bicamada de interface de gotícula em eletrodos do tipo fio. Ver em primeira mão o processo de dispensação e posicionamento de gotículas em eletrodos simplifica essa técnica para a formação de bicamadas, tornando-a imediatamente acessível a todos. Joseph Najem, um pós-doutor do meu laboratório.
Para começar, prepare a solução de estoque de alamethicina no tubo de microcentrífuga dissolvendo o peptídeos de alamethicina em pó no etanol para uma concentração final de 2,5 miligramas por mililitro. Vortex o tubo brevemente para misturar bem, e armazenar a solução de estoque em um congelador de menos 20 graus Celsius. Em um tubo de bloqueio seguro de 1,5 mililitro, adicione um microliter de solução de estoque de alamethicina a 99 microliters de solução A para alcançar uma concentração final de alamethicina de 13 micromolar na suspensão liposomia.
Vórtice para misturar bem. A solução liposso de peptídeo resultante é a solução B.Mix 117 microliters de solução A com 10 microliters de solução B para alcançar uma concentração final de alamethicina de um micromolar, e depois vórtice para misturar bem. Consulte a solução resultante como C.Store as soluções B e C a quatro graus Celsius.
Coloque um lado de vidro de um milímetro de espessura 25 vezes 75 milímetros no estágio de um microscópio invertido. Distribua algumas gotas de óleo de hexadecano no centro do deslizamento de vidro e, em seguida, coloque o reservatório de óleo diretamente sobre o óleo na lâmina de vidro. Encha completamente o reservatório de óleo com óleo de hexadecano.
Certifique-se de que o reservatório está posicionado acima da lente objetiva. Em seguida, conecte o suporte de eletrodo ao estágio da cabeça de um amplificador de corrente montado em um micromanipulador. O micromanipulador minimiza o comprimento do eletrodo e o ruído elétrico.
Em seguida, monte o suporte de micropipette de vidro com o segundo fio prata-prata-cloreto em outro micromanipulador. Usando os micromanipuladores, posicione os eletrodos de tal forma que as pontas revestidas de agarose dos fios de prata-prata-cloreto estão totalmente submersas no reservatório de óleo em um plano vertical semelhante. Alinhe os dois eletrodos e separe-os por alguns milímetros.
Para formar o bicamado lipídedo, mova os eletrodos verticalmente para a fase do óleo. Use a micropipette para depositar 200 nanoliters de solução lipídica A em cada um dos fios. Aguarde de três a cinco minutos para permitir que o conjunto de monocamadas lipídicas espontâneas ocorra na interface do óleo de água.
Gotículas podem ceder se o óleo circundante for suficientemente menos denso. Depois disso, baixe os eletrodos para re-submergir até que as extremidades de ambos os eletrodos mal toquem o fundo do reservatório de óleo. Em seguida, para formar o bicamado, mova os eletrodos horizontalmente para trazer as gotículas em contato.
Para obter a relação beliscada, histerética, corrente-tensão, use um gerador de função para aplicar a forma de onda de tensão triangular ou sinusoidal a uma membrana lipídica livre de alamethicina montada com gotículas da solução A.Registre a resposta corrente induzida em várias frequências. Para registrar o tamanho da bicamada lipídica interfacial, medir o diâmetro da membrana lipídica no computador ou registrar a amplitude de corrente de pico a pico resultante da onda triangular de 10 hertz, 10 milivolts para calcular a área da membrana. Retire os fios da fase do óleo para remover as gotículas que não contêm alamethicina.
Adicione novas gotículas aquosas usando a solução C e forme uma bicamada lipídica. Com base na amplitude de corrente de onda quadrada, use os micromanipuladores para ajustar o contato entre gotículas, de modo que o bicamado tem uma área semelhante à formada anteriormente. Em seguida, aplique uma forma de onda de tensão de 10 hertz e 10 milivolts e regise a resposta corrente induzida como anteriormente.
Para realizar experimentos de pulso usando um software de programação personalizado e fonte de tensão analógica, gere pulsos de tensão com amplitudes específicas altas e baixas no tempo e fora do tempo. Regissão a corrente em resposta aos pulsos aplicados. O enredo de corrente versus tensão mostra a resposta de corrente não-zero após a aplicação de um viés de tensão a um bicamheiro lipíduo sem alamethicina.
Adicione 0,017 hertz, uma frequência onde a impedância é dominada pela resistência à membrana. Uma resposta de corrente de baixa ómica é mostrada para a membrana altamente isolante. O enredo de um bicamado lipída formado entre duas gotículas contendo peptídeos de alamethicina mostra correntes exponencialmente crescentes em tensões superiores ao limiar de inserção de 100 milvolts.
Em alta tensão, peptídeos de alamethicina residentes na superfície do bicamadorão lipídial inserem na membrana e agregam para formar poros condutores. As respostas de corrente simétrica em ambas as polaridades se devem à inserção e agregação de populações separadas de peptídeos de lados opostos da membrana. A corrente capacitiva deve ser subtraída da corrente total para obter apenas a resposta de corrente de histerese ressulada e memristiva.
A resposta do memristor biomolecular aos pulsos de tensão subsequentes com um aumento na conduance durante o tempo, apesar de restaurar intermitentemente um estado isolante durante cada tempo de folga. Tanto o estímulo presente quanto os estímulos prévios contribuem para o aumento atual. Monocamadas coesas em ambas as gotículas devem se formar antes de juntá-las para formar a bicamada.
Se as gotículas forem reunidas muito cedo, elas se fundem e nenhuma bicamada é formada. Estamos agora projetando e fabricando redes neurais de base microfluidas que consistem em neurônios de estado sólido conectados por sinapses baseadas em membrana suportadas pela otimização de assimilação de rede de supercomputadores de alto desempenho na ORNL. Esses memristors são os primeiros a ter a composição, estrutura, mecanismo de comutação e transporte de íons de sinapses biológicas.
Assim, eles fornecem uma base biomolecular fornecida adicionando computação e memória semelhantes ao cérebro.
