O método MycoPatt permite uma exploração em profundidade da colonização micorrízica arbuscular em raízes. Os mapas micorrízicos apontam para a expansão fúngica e apresentam a posição real de cada estrutura como um padrão específico. A colonização micorrízica é objetivamente analisada a 1% de resolução.
Cada segmento raiz é automaticamente convertido em uma matriz digital e gera um extenso banco de dados de parâmetros de colonização. Para começar, retire as raízes da geladeira e coloque-as em uma plataforma de trabalho para descongelar à temperatura ambiente. Para realizar a limpeza das raízes, coloque todas as raízes de uma planta em um frasco de 30 a 50 mililitros, em seguida, prepare uma solução de hidróxido de sódio a 10% com água da torneira e despeje-a no frasco até cobrir completamente as raízes.
Agitar vigorosamente o frasco durante um a dois minutos para dispersão homogénea da solução de limpeza nas raízes. Deixe as raízes permanecerem na solução de limpeza por 48 horas. Para enxaguar as raízes, passe o conteúdo do frasco através de uma peneira.
Lave as raízes várias vezes em água da torneira até que a solução de limpeza seja completamente removida. Em seguida, coloque as raízes enxaguadas em um frasco limpo para colorir. Em seguida, prepare uma solução de vinagre de tinta de cinco a cinco por cento com água da torneira.
Despeje-o no frasco até cobrir as raízes e agite-o por um a dois minutos. Após 48 horas para a coloração parcial, enxaguar as raízes coradas em água da torneira por um a dois minutos. Agite o frasco vigorosamente para remover a solução de coloração extra.
Repita o procedimento até que as raízes estejam claras para avaliação microscópica. Para segmentação radicular, coloque as raízes manchadas em uma tábua de corte em escamas. Corte as raízes em segmentos de um centímetro.
Escolha 15 segmentos para cada variante. Em seguida, espalhe as raízes em uma lâmina para preparação do segmento, use uma bolsa de laminação para cobrir as raízes e esmagá-las suavemente, começando por uma borda. Use uma ferramenta de plástico macio para exibir as raízes no slide.
Remova cuidadosamente a bolsa de laminação e cubra a amostra com um deslizamento de cobertura. Adicione água a um canto do escorregador com uma pipeta e deixe a água se espalhar lentamente no escorregador. Retire a água extra com uma toalha de papel.
Para análise microscópica, use um microscópio equipado com uma câmera de boa resolução. Analise os slides a partir de uma extremidade. Capture cada campo microscópico.
Use uma ampliação de 10 ou 40x para raízes grossas e 40x para raízes finas. Após a captura, renomeie cada imagem com um código que permitirá a pós-montagem real de peças raiz. Use o software de apresentação para projetar uma prancheta de desenho para montagem de imagens, defina a largura de dois a três centímetros a mais do que a largura da imagem.
Depois de capturar 15 imagens, adicione todas as imagens capturadas de um segmento na ordem de captura, começando com uma a 15, e reconstrua todo o comprimento do segmento raiz. Em seguida, use o alinhamento vertical para alinhar as imagens no centro e garantir que cada imagem siga a anterior. Coloque uma grade de 10 por 150 células em todas as imagens para cobrir todo o segmento raiz.
Além disso, coloque uma grade de 10 por 10 em cada imagem e, em cada célula dessa grade, insira um número de um a seis se uma estrutura micorrízica arbuscular ou AM estiver visível, ou deixe em branco se nenhuma estrutura AM estiver presente. Adicione uma tabela para uma grade de 10 células de largura e 150 células de comprimento. Altere a tabela com dimensões para a largura das imagens e, em seguida, altere o comprimento da tabela para incluir todas as imagens.
Para pontuar a colonização micorrízica, use o número único para pontuar cada tipo de estrutura, conforme descrito no método do padrão micorrízico. Use um para hifas, dois para arbúsculos, três para vesículas, quatro para esporos, cinco para células auxiliares e seis para pontos de entrada. Pontuar cada estrutura micorrízica observada de cada célula das grades aplicadas anteriormente.
Após a pontuação, insira todos os escores obtidos na planilha do MycoPatt. Use a função copiar e colar para transferir todas as pontuações da apresentação para a primeira planilha chamada Dados Brutos. Para a análise primária, use a terceira folha chamada Parâmetros para visualizar os resultados como porcentagens separadamente em três formulários.
Use as colunas A a K para analisar a imagem horizontal da colonização, as colunas M a W para a imagem vertical da colonização e as colunas Y a AI para analisar a colonização transversal para cada um dos 15 10 por 10 quadrados e a colonização média final. Em seguida, aplique as definições e fórmulas específicas para cada parâmetro. Para produção e extração de mapas micorrízicos, visualize a imagem obtida a partir da conversão do código de estruturas micorrízicas em cores na segunda folha denominada Gráficos.
Em seguida, exporte a imagem resultante na folha do gráfico como uma imagem e use o código de cores na legenda para analisar padrões micorrízicos. Para a análise do mapa micorrízico, identifique as estruturas mais importantes e sua montagem. Em seguida, descrever o padrão de colonização micorrízica observado nas raízes analisadas, seguido de uma estratégia de colonização baseada no desenvolvimento estrutural observado na raiz, no padrão de ramificação e no desenvolvimento da vesícula arbuscular.
Este protocolo fornece os detalhes das estruturas micorrízicas com bom contraste entre as estruturas micorrízicas e as células radiculares de Zea mays e rubra festal. Os procedimentos malsucedidos de limpeza e coloração resultaram em imagens microscópicas pouco claras de estruturas micorrízicas em rubra festal e Zea mays. Os padrões de colonização micorrízica permitiram uma exploração completa do mecanismo de colonização, este método fornece uma exploração profunda e em pequena escala dos padrões e estratégias de colonização para Zea mays e Festuca rubra com uma expressão visual adicional dos parâmetros de colonização.
Em Zea mays observou-se potencial de colonização altamente flutuante dependendo do estágio de desenvolvimento da planta, no entanto, em Festuca rubra, os processos de colonização ocorrem dentro das raízes e o desenvolvimento de redes hifais foi correlacionado com uma baixa velocidade de desenvolvimento das raízes. O MycoPatt é adequado para mapear a colonização micorrízica arbuscular em qualquer planta. Também é útil explorar completamente o mecanismo de colonização e avaliar a estratégia fúngica ao longo das raízes.
