A avaliação do engajamento-alvo, ou seja, a interação de uma droga com a proteína para a que foi projetada, é um requisito básico para a interpretação da atividade biológica de qualquer composto no desenvolvimento de medicamentos, ou em projetos básicos de pesquisa. A principal vantagem desta técnica é que permite a medição direta do efeito da dose e a dinâmica do engajamento do alvo KDM1A, em vez de medições de efeitos a jusante, como marcas de histona e expressão. Essa técnica pode ser aplicada em pesquisas básicas e também em ensaios clínicos, em CNS oncológico ou outras doenças sujeitas ao tratamento com inibidor de KDM1A para estudar farmacodinâmica.
Esta técnica é baseada em uma quimioterapia desenvolvida para estudar ORY-1001, iadademstat, mas pode ser realmente usada para outros inibidores de KDM1A e a estratégia pode ser aplicada a outros alvos. O procedimento será demonstrado por Raquel Ruiz, gerente de operações da plataforma de descoberta PK/PD do meu laboratório. Durante o tratamento celular com ORY-1001 o composto se liga à proteína KDM1A presente no núcleo.
Para iniciar este procedimento, recupere uma alíquota de uso único de 10 microliteres de 20 mililitros biotiniled sonda OG-881 solução de estoque da geladeira e deixe-a aquecer à temperatura ambiente por 10 minutos. Usando um micropipet com pontas de filtro, diluir em série a solução de estoque para preparar a solução de trabalho de dois micromolares. Em seguida, dissolva um comprimido de inibidor de protease em um mililitro de PBS em um tubo de microcentrifuuge.
Para cada mililitro do volume desejado de 1x tampão de lise celular com o quimióbio, misturar 100 microliters de tampão de lise celular de 10x obtidos comercialmente, 150 microliters do inibidor de protease de 10x, 12,5 microliters das duas soluçãos de trabalho micromolar OG-881 e 737,5 microliters de água dupla destilada tipo 1. As células são lísedas em 1x tampão de lise na presença da quimioterapia que se liga a qualquer proteína KDM1A livre. Para se preparar a partir de tecidos, use uma argamassa e pilão que são refrigerados em gelo seco para pulverizar e homogeneizar um pedaço cúbico de centímetro de tecido congelado.
Aliquotar o tecido em frascos de uso único, certificando-se de transferir aproximadamente 40 miligramas de pó de tecido para cada frasco, evitando descongelar o tempo todo. Armazene as amostras a 80 graus Celsius até que estejam prontas para o processo. Para se preparar a partir de pelotas celulares, resuspenha a pelota de aproximadamente 10 milhões de células em 200 microliters de 1x tampão de lise celular contendo 25 nanomolar OG-881.
Vórtice cada amostra brevemente e mantê-los no gelo por cinco minutos. Usando um sonicator, sonicate as amostras com três pulsos a 45 kilohertz durando 20 segundos cada. Coloque as amostras no gelo por 20 segundos entre os pulsos.
Mantenha as amostras no gelo por mais cinco minutos. Em seguida, o vórtice brevemente e centrífuga as amostras a 14.000 vezes G por 10 minutos em uma centrífuga que é pré-refrigerado a quatro graus Celsius. Usando um micropipet de um mililitro, transfira cada supernacido em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro.
Deixe os tubos no gelo por duas horas antes de processar. Em seguida, quantifique a proteína nativa usando o ensaio de Bradford, conforme descrito no protocolo de texto. Uma placa total é revestida com anticorpo anti-KDM1A.
Placa livre é revestida com streptavidin. O lysato celular é então adicionado às duas placas e o complexo KDM1A é capturado diretamente ou através da quimioterapia. As placas são lavadas e incubadas com o anticorpo de detecção anti-KDM1A e um anticorpo secundário acoplado à peroxidase de rabanete.
Finalmente, substrato luminescente é adicionado e gerado sinal. Para o total de KDM1A ELISA, prepare 10 mililitros de anticorpo de captura KDM1A em PBS para uma concentração final de dois microgramas por mililitro para cada placa. Transfira 100 microliters para cada poço da placa.
Para o KDM1A ELISA gratuito, prepare 10 mililitros de streptavidina na PBS como uma concentração de 10 microgramas por mililitro para cada placa. Transfira 100 microliters para cada poço da placa. Em seguida, selar cada placa com filme adesivo e incubar durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, retire as placas da geladeira e deixe que elas se equilibrem à temperatura ambiente por aproximadamente 45 minutos. Lave cada placa três vezes com tampão de lavagem, certificando-se de tocar a placa em toalhas de papel após cada etapa de lavagem para remover qualquer solução residual. Adicione 200 microliters de tampão de bloqueio a cada poço de ambas as placas.
Feche as placas com filme adesivo e incubar em temperatura ambiente por duas horas. Enquanto isso, diluir os extratos de proteína nativas obtidos anteriormente com PBS para a concentração apropriada e estabelecer a placa para preparar uma curva padrão usando rKDM1A humano como descrito no protocolo de texto. Após a conclusão da incubação de duas horas, descarte o tampão de bloqueio e lave as placas com tampão de lavagem, certificando-se de tocar a placa em toalhas de papel após cada etapa de lavagem para remover qualquer solução residual.
Transfira as amostras diluídas apropriadas para um bloco de armazenamento de poços profundos refrigerado 96 após a distribuição da placa encontrada na tabela dois do protocolo de texto. Mantenha este bloco no gelo enquanto tubos 100 microliters por poço no total e livre placas ELISA seguindo a distribuição da placa encontrada na tabela três do protocolo de texto. Incubar em temperatura ambiente por uma hora, depois descartar as amostras e lavar as placas cinco vezes com tampão de lavagem.
Prepare 20 mililitros de anticorpo de detecção anti-KDM1A de coelho no bloqueio de buffer a uma concentração de 0,125 microgramas por mililitro. Adicione 100 microliters da solução de anticorpos de detecção a cada poço de ambas as placas, exceto aqueles correspondentes aos controles negativos. Cubra as placas com filme adesivo e incubar em temperatura ambiente por uma hora.
Depois disso, descarte a solução de anticorpos de detecção e lave as placas seis vezes com tampão de lavagem. Prepare 25 mililitros de anticorpo anti-coelho de cabra secundário, HRP, para uma diluição de 1 a 5.000 no tampão de bloqueio. Adicione 100 microliters da solução de anticorpos secundários a cada poço das placas de microtítiter e incubar à temperatura ambiente por uma hora.
30 minutos antes do término desta incubação, misture partes iguais de melhorador de luminol e solução de peróxido em uma garrafa âmbar sob condições de luz macia. Deixe essa mistura em temperatura ambiente. Quando a incubação de uma hora estiver completa, descarte a solução secundária de anticorpos e lave as placas seis vezes com tampão de lavagem.
Em seguida, pipet 100 microliters da solução de trabalho luminol para cada poço das placas, certificando-se de pipet muito lentamente para evitar a formação de bolhas. Use um temporizador para controlar o tempo entre a adição da solução e a medição de luminescência das placas e mantenha este tempo constante para obter uma boa reprodutibilidade entre ensaios. Feche as placas com filme adesivo e centrífuga a 500 vezes G e à temperatura ambiente por 45 segundos para eliminar quaisquer bolhas restantes.
Incubar as placas em um agitador de pratos a 100 rpm por um minuto. Em seguida, remova a película adesiva e insira a placa em um leitor de microplacão e deixe-a por três minutos para estabilizar a temperatura a 25 graus Celsius. Leia as unidades relativas de luminescência de cada ensaio de placa ELISA.
Salve e copie os valores brutos de RLU dos arquivos de planilha de dados brutos para análise posterior. Neste estudo, um novo ELISA baseado em captura de quimioterapia KDM1A é usado para medir diretamente o engajamento do alvo KDM1A em células e amostras de tecido. Os valores RLU de rKDM1A total e livre são avaliados para verificar a linearidade.
Os valores RLU de KDM1A total e gratuito detectados em PBMCs humanos de três voluntários independentes são então sobrepostos na curva padrão. As células AML são cultivadas seguindo as recomendações do provedor e são tratadas com qualquer veículo ou ORY-1001 em diferentes concentrações. O extrato de proteína nativa é obtido na presença de 25 milimônios OG-881 chemoprobe e 0,5 microgramas de proteína total é usado para realizar a análise do engajamento-alvo.
KDM1A total e gratuito são então determinados e as porcentagens de engajamento-alvo de ORY-1001 para KDM1A são calculadas em relação ao veículo. O engajamento direcionado de KDM1A responsivo em PBMCs e no tratamento pulmonar de ratos com ORY-1001 por gavage oral, calculado relativo o grupo de veículos é mostrado aqui. A incubação ex vivo com 25 ory-1001 nanomolar de extratos de proteína pulmonar dos animais tratados com veículos, produz TE completo, no entanto, mas não aumenta ainda mais o TE em amostras de ratos tratados por quatro dias com 30 microgramas por quilograma ORY-1001, confirmando que o KDM1A já estava totalmente inibido in vivo.
Este protocolo avalia o engajamento de alvos do KDM1A medindo KDM1A gratuito e total. Lembre-se que requer extração de proteína nativa. Esta técnica pode ser usada em amostras de diferentes espécies para avaliar um inibidor específico, também para testar novos inibidores.
A quimioterapia utilizada neste estudo também pode ser aplicada para quimioproteômica para estudar o interajoo KDM1A. Lembre-se de trabalhar com segurança e respeito em todas as medidas preventivas ao manusear amostras biológicas e compostos bioativos como o inibidor KDM1A.
