Este é um novo método para a avaliação do hormônio glicocorticoide, cortisol, de pele de coala. Ele fornece um novo biomarcador para a avaliação do estresse crônico em coalas. A principal vantagem desta técnica é que ela é um método altamente sensível e reprodutível com um tempo de reviravolta bastante rápido entre a preparação da amostra e o ensaio hormonal.
Esta técnica permite a avaliação quantitativa do estresse crônico em coalas, que é uma ferramenta de gestão clínica altamente útil. Me ajudando com esse procedimento está Dylan Fox, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para iniciar este procedimento recupere a pele do armazenamento a menos 80 graus Celsius e deixe descongelar à temperatura ambiente.
Em seguida, pese a pele em uma balança de precisão analítica de laboratório. Coloque 60 miligramas da pele em um tubo de centrífuga pré-pesado e rotulado de 1,5 mililitro e repita isso até que 18 tubos estejam cheios. Usando uma pipeta, adicione um mililitro de isopropanol de grau 100% HPLC a cada tubo.
Vórtice as amostras por 30 segundos. Coe cada amostra com uma peneira de micro-precisão de 0,5 mililitro para alcançar a separação de líquido e pele, e descarte o líquido em um recipiente de resíduos. Coloque cada amostra de pele em um barco de pesagem de plástico rotulado.
Em seguida, coloque os barcos de pesagem em um desiccador a vácuo e deixe por três dias para deixar a pele secar. Uma vez que a pele esteja completamente seca, coloque cada amostra em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado. Coloque cada amostra em uma fábrica de contas com três contas de aço cromadas e pulverize por dois minutos a 30 shakes por segundo.
Repita esta transferência com metanol de grau 100% analítico e isopropanol de grau 100% analítico até que 18 tubos totais tenham sido preenchidos. Depois disso, use uma pipeta para transferir um mililitro da primeira técnica de extração em seis tubos de centrífuga de 1,5 mililitro contendo a amostra de pele. Tampe cada tubo e use um agitador para incuba-los à temperatura ambiente com pulsação constante por pelo menos 12 horas.
Em seguida, coe as amostras com uma peneira de micro-precisão de 0,5 mililitro. Use uma pipeta para transferir o líquido para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulado, ao mesmo tempo em que garante que a pele seja descartada adequadamente. Em um capô de fumaça, tente completamente o extrato de solvente sob um fluxo de vapor de nitrogênio.
Em seguida, reconstituir a amostra seca com 400 microliters de tampão de ensaio e 100 microliters de etanol de grau 100% analítico. Para fazer os controles, selecione primeiro amostras de animais com exposição conhecida ao estressor. Para fazer uma piscina de extratos, pegue 20 microliters de extrato de cada amostra até que um volume total de 200 microlitres seja obtido.
Armazene a piscina de extrato a menos 80 graus Celsius até que esteja pronto para executar os ensaios. Quando estiver pronto, obtenha o fator de diluição para os pontos de ligação de 30% e 70% do gráfico de paralelismo para o extrato contra o padrão cortisol, e use tampão de ensaio para diluir o pool de amostras adequadamente para criar os controles altos e baixos. O uso de um kit comercial de cortisol configurou uma placa de tira de 96 poços, incluindo amostras, controles, padrões de cortisol, poços de ligação inespecífica e poços de ligação máxima de acordo com as instruções do fornecedor.
Use a folha de layout da placa incluída no folheto do kit para listar as posições das amostras, controles e padrões. Em seguida, siga o processo de extração hormonal de pele descrito anteriormente para obter pele de coala extraída de 100% de metanol. Prepare os reagentes do kit de cortisol de acordo com as instruções do fabricante.
Pipeta 50 microliters de amostras ou padrões nos poços da placa. Pipeta 75 microliters de tampão de ensaio nos poços de ligação não específica, e 50 microliters de tampão de ensaio nos poços de ligação máxima. Usando uma pipeta repetidor adicione 25 microliters do cortisol conjugado a cada poço.
Em seguida, pipeta 25 microliters do anticorpo cortisol em cada poço, exceto os poços de ligação inespecífica. Bata suavemente nas laterais da placa para garantir que os reagentes estejam bem misturados. Cubra a placa com o selador da placa e use um agitador orbital para agitar à temperatura ambiente por uma hora.
Depois disso, remova o selo da placa e aspire a placa do poço lavando cada poço com 300 microliters de tampão de lavagem quatro vezes. Em seguida, seque a placa batendo-a em toalhas absorventes limpas. Pipeta 100 microliters de substrato de tetrametilbenzidina para cada poço.
Coloque o selador de placa na placa do poço e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, pipetas 50 microliters de solução stop em cada poço. Transfira a placa para um leitor de placas capaz de ler 450 nanômetros e calcule a concentração hormonal final conforme descrito no protocolo de texto.
Neste estudo, a detecção de ensaios de metabólitos hormonais de interesse é determinada por meio do paralelismo. Na curva de paralelismo, o ponto de ligação de 50% determina o fator de diluição amostral na curva padrão. Como se pode ver, os extratos de 100% etanol e isopropanol 100% não proporcionaram deslocamento paralelo em relação ao padrão cortisol.
No entanto, o extrato de 100% de metanol fornece deslocamento paralelo contra o padrão cortisol. Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio são determinados a partir de extratos de amostra de alta e baixa ligação executados em todos os ensaios. Os controles internos de baixa ligação são vistos como um pool de extrato de coala puro, enquanto os controles internos de alta ligação são vistos como uma piscina de extrato de coala diluído de um para dois.
A associação entre cada extrato de solvente e padrão de cortisol é então determinada por meio de um plot de regressão. O extrato de 100% de metanol fornece a melhor linha de regressão com o maior valor R-quadrado em comparação com os extratos de 100% etanol e isopropanol de 100%. É importante lembrar que a etapa de lavagem amostral deve ser realizada antes de moer as amostras para evitar a perda de hormônios esteroides.
Após este procedimento, podemos medir outros hormônios esteroides, como hormônios reprodutivos para olhar as interações entre estresse e reprodução em coalas. Esta técnica fornece uma nova ferramenta para o campo emergente da fisiologia da conservação, permitindo a avaliação não invasiva do cortisol na pele de coala. O kit comercial de cortisol fornece reagentes em quantidade minuciosa.
No entanto, é importante usar equipamentos de proteção individual para minimizar a lesão a si mesmo durante a condução deste procedimento laboratorial.
