A questão-chave que queremos abordar com este método é como podemos usar amostras de RNA de materiais comprados em mercados locais de alimentos para a clonagem de genes biotecnologicamente relevantes? Aqui, usamos ostras do Pacífico como um estudo de caso para demonstrar essa abordagem e potencial aplicação adicional. A principal vantagem desta técnica é que o sequenciamento convencional do genoma ou cDNA das amostras de ostra pode ser contornado.
Em vez disso, sequências da subunidade citocromática c oxidase I e NADH desidrogenase foram comparadas com sequências de referência disponíveis publicamente da ostra do Pacífico para selecionar o espécime mais intimamente relacionado. O cDNA preparado a partir deste espécime pode ser usado diretamente para a clonagem de genes biotecnologicamente relevantes, que podem ser selecionados usando as informações de sequência pública. Demonstrando o procedimento estarão Yongmei Lyu e Yuquan Li, dois estudantes de pós-graduação do Centro de Pesquisa em Bioengenharia Glicânica e Gliccano da Universidade Agrícola de Nanjing.
Para preparar a amostra de tecido de ostra, use um bisturi esterilizado para cortar aproximadamente 100 miligramas de tecido mole homogêneo do centro geométrico aproximado de cada espécime de ostra. Transfira a amostra para uma argamassa cheia de 50 mililitros de nitrogênio líquido. Triture o tecido de ostra congelado em um pó fino.
Pesar 75 miligramas do tecido congelado de cada espécime em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e se misturar com um mililitro de reagente de extração de tiocianato-fenol de guanidinium. O passo mais crítico deste procedimento é a etapa de extração do RNA. Para minimizar a degradação do RNA, é essencial reduzir o tempo entre a colheita do tecido de ostra e a extração do RNA.
Centrifugar a amostra a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos. Transfira o supernatante para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, adicione 200 microlitadores de clorofórmio e misture bem em um misturador de vórtice por 10 a 15 segundos até que a mistura fique branca leitosa. Em seguida, centrífuga por 15 minutos como feito anteriormente.
Com uma pipeta de 200 microliter, transfira cuidadosamente a camada aquosa superior, sem perturbar a interfase, em um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 500 microliters de álcool isopropílico no tubo centrífuga e inverta suavemente para misturar as amostras. Em seguida, deixe as amostras no gelo por 20 minutos.
Centrifugar a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por oito minutos, e remover o supernante. Resuspense a pelota em um mililitro de 75% de etanol, e centrífuga a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Retire todo o supernatante e repita a lavagem no etanol.
Seque as pelotas por seis minutos em temperatura ambiente. Em seguida, dissolva a pelota de RNA seca em 25 microliters de água tratada com DEPC, e mantenha o tubo no gelo. Use as amostras de RNA dentro de 24 horas.
Para gerar uma biblioteca cDNA, primeiro prepare uma mistura de reação para cada amostra de RNA em um tubo PCR de 300 microliter adicionando soluções de acordo com o manuscrito. Adicione um microliter da amostra de RNA extraída no tubo. Incubar a mistura em um termociclador PCR por 60 minutos a 42 graus Celsius e, em seguida, aumente a temperatura para 95 graus Celsius por cinco minutos.
Armazene a biblioteca cDNA gerada por até 12 meses a menos 20 graus Celsius. Primeiro, adicione um microliter da biblioteca cDNA gerada aos tubos contendo misturas PCR, preparados de acordo com o manuscrito. Coloque os tubos PCR no termociclador PCR e realize a amplificação do PCR com uma etapa inicial de desnaturação e 35 ciclos de reação PCR consistindo em um passo de ressarcialização, uma etapa de alongamento e uma etapa de desnaturação de acordo com o manuscrito.
Após os ciclos, realize uma etapa de alongamento finalizadora por cinco minutos. Use cinco microliters do produto PCR para verificar a qualidade por eletroforese de gel agarose. Observe o gene COX1 ou ND amplificado como uma única banda em 759 ou 748 pares de base, respectivamente.
Para purificar o resto do produto PCR, adicione 100 microliters de tampão de ligação de DNA contendo altas concentrações de sais chaotrópicos a cada amostra. Vórtice brevemente para misturar o conteúdo. Coloque uma coluna de purificação em um tubo de centrífuga de dois mililitros.
Pipeta a mistura de reação na coluna. Coloque o tubo com a coluna montada em uma centrífuga a 14.000 vezes g durante um minuto em temperatura ambiente. Depois de descartar o filtrado do tubo centrífuga de dois mililitros, lave duas vezes com 700 e 400 microliters de solução de lavagem W2 por centrifugação a 14.000 vezes g.
Em seguida, aqueça um mililitro de água deionizada a 65 graus Celsius em um aquecedor de blocos de metal. Transfira a coluna para um novo tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e 25 microliters da água desorganizada pré-aque para o centro da membrana da coluna branca. Deixe a membrana absorver por um minuto em temperatura ambiente.
Em seguida, centrifufique o tubo com a coluna a 14.000 vezes g por um minuto em temperatura ambiente. Descarte a coluna e armazene o produto PCR purificado por até 12 meses a menos 20 graus Celsius. Opcionalmente, os primers reversos COX1 ou ND também podem ser usados para sequenciamento bidirecional.
Para sequenciamento Sanger, use o primer avançado RELEVANTE COX1 ou ND. Depois de recuperar os resultados de sequenciamento, compare as sequências com a sequência de genoma da cepa de referência de ostra do Pacífico usando a ferramenta on-line NCBI Nucleotide BLAST. Use os respectivos primers dianteiros e invertidos dos genes MgUGD e MgUXS para amplificar e purificar pelo PCR, como feito anteriormente.
Depois de incubar produtos PCR purificados com tampão de digestão, prepare o vetor pET-30a predigested dissolvendo 500 nanogramas de pET-30a em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e adicione água deionizada para completar até 16 microlitugas. Em seguida, adicione dois microlitadores de tampão de digestão 10 vezes concentrado e um microliter cada uma das 20 unidades de restrição endonucleases Nde1 e Xho1 no tubo. Incubar a mistura a 37 graus Celsius por três horas.
Depois disso, adicione um microliter de fosfattase alcalina de uma unidade e incubar a 37 graus Celsius por mais uma hora. Em seguida, coloque o tubo em um aquecedor de bloco metálico pré-aquecido a 75 graus Celsius por 10 minutos para inativar a fosfatase alcalina. Depois de cultivar células E.coli BL21 com os genes MgUGD e MgUXS, transfira a cultura para um meio LB de 400 mililitros em um frasco de dois litros, e coloque-a em um shaker a 200 rpm a uma temperatura de 37 graus Celsius.
Após três horas, verifique a densidade óptica em um fotômetro em um comprimento de onda de 600 nanômetros, e certifique-se de que ele atinge uma absorção de aproximadamente 0,5. Em seguida, reduza a temperatura do agitador para 20 graus Celsius. Adicione 400 microliters de IPTG de um molar para induzir a expressão das proteínas recombinantes por três horas.
Depois de colher as células, interrompa as células por sônica por 20 minutos a quatro graus Celsius. Centrifugar a 14.000 vezes g e quatro graus Celsius por 20 minutos, e coletar o supernasal em um novo tubo para o teste de atividade. Após o ensaio de atividade, sacie as reações adicionando 20 microliters de metanol e 40 microliters de clorofórmio às misturas MgUXS e MgUGD.
Vórtice as misturas de amostra, e centrífuga a 14.000 vezes g durante seis minutos e quatro graus Celsius. Colete a camada aquosa superior de cada tubo em novos tubos para espectrometria de massa MALDI-TOF. Neste experimento, o alinhamento sequencial das sequências genéticas COX1 e ND de um espécime altamente divergente foi comparado com a linha de ostras do Pacífico de referência.
As setas vermelhas mostram diferenças de nucleotídeos entre a sequência de referência e a sequência das amostras de cDNA obtidas. As sequências dos genes COX1 e ND de um espécime de ostra intimamente relacionado mostram baixa divergência da linha de ostras do Pacífico de referência. A espectrometria de massa MALDI-TOF mostra a aplicação bem sucedida da biblioteca cDNA para clonar os genes industrialmente relevantes MgUGD e MgUXS.
A imagem em gel também identifica o ácido UDP-glucuronic e o UDP-xilose gerado pela ação enzimática do MgUGD e MgUXS sucessivamente expressos e purificados. Este método não requer uma combinação perfeita entre a sequência de referência e as sequências de marcadores obtidas e deve dar ao pesquisador confiança para trabalhar com ostras nãoferências. Em princípio, este método pode ser aplicado a qualquer amostra biológica nãoferência para a qual sequências de uma espécie de referência intimamente relacionadas estão disponíveis publicamente.
Este método permite que pesquisadores não especialistas acessem facilmente material genético de potencial importância biológica e abre caminho para que mais cientistas trabalhem com amostras biológicas facilmente acessíveis, mas incompletamente identificadas.
