Sou Martin Ryll, dos laboratórios de pesquisa do Departamento de Cirurgia Geral, Visceral e transplantada da LMU em Munique. Hoje vamos mostrar um modelo de transplante aórtico heterotópico murine usando uma técnica modificada de manguito não sutura. Primeiro, anestesiar o animal receptor com uma injeção intraperitoneal de midazolam, medetomidina e fentanil.
Corte todos os cabelos da região lateral cervical com um cortador de cabelo elétrico para animais pequenos e aplique pomada oftalmica com cotonetes de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento. Coloque o animal na posição supina em uma almofada de aquecimento sob o microscópio e grave suavemente as pernas na mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele. Incline a cabeça para trás e esfregue o campo operacional várias vezes com álcool.
Faça uma incisão de pele da incisão jugular para a mandíbula inferior direita com uma tesoura pequena. Remova o lobo inferior direito da glândula submandibular através de cautery bipolar do pediculo do vaso e excisão subsequente com micro tesoura. Remova o músculo estenicleidomastoide direito através do cautery bipolar da porção superior e inferior e excisão subsequente com micro tesoura para ter acesso à artéria carótida comum.
Mobilize a artéria carótida comum o mais longe possível, puxando o tecido conjuntivo circundante com fórceps finos. Amarre duas ligaduras de seda 7-0 com distância mínima entre si ao redor do meio da artéria carótida comum e transecte a artéria carótida comum com micro tesoura fina entre as ligaduras. Passe a extremidade ligada proximal através da braçadeira e fixe-a com um pequeno grampo de artéria.
Remova a ligadura com uma micro tesoura fina o mais próximo possível da ligadura e lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso. Distende o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e inverta o toco carótida sobre o manguito puxando-o suavemente sobre o tubo de poliamida. Fixar imediatamente a carótida invertida com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado.
Realize o mesmo procedimento na outra extremidade da artéria carótida com a outra braçadeira. Passe a extremidade distal ligada através da braçadeira e fixe-a com um grampo de artéria pequeno. Remova a ligadura com uma micro tesoura fina o mais próximo possível da ligadura e lave o lúmen com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso.
Distende o lúmen aberto usando dilatadores vasculares finos e inverta o toco carótida sobre o manguito puxando-o suavemente sobre o tubo de poliamida. Fixar imediatamente a carótida invertida com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado. Desista o animal receptor e hidrate o dois terço superior com soro fisiológico até que o segmento aórtico seja explantado.
Anestesiar o rato doador da mesma forma que o animal receptor. Corte todos os cabelos da região abdominal e torácica com um cortador de cabelo elétrico para animais pequenos e aplique pomada oftalmica com cotonetes de algodão para evitar que os olhos sequem durante o procedimento. Coloque o animal na posição supina em uma almofada de aquecimento sob o microscópio e grave suavemente as pernas na mesa de operação com tiras de gesso sensíveis à pele.
Esfregue o campo operacional várias vezes com álcool. Realize uma laparotomia abdominal média com uma tesoura pequena e empurre os intestinos ligeiramente para cima para expor a cava vena inferior. Injete o IVC com um cc de soro fisiológico heparinizado usando uma agulha calibre 30.
Corte a aorta abdominal e o IVC abaixo das artérias renais com uma pequena tesoura para exsanguinar o animal doador. Coloque uma compressa no abdômen para absorver o sangue. Realize uma toracotomia através de desvio bilateral das costelas com tesouras e incline a parede do peito anterior cranialmente com um grampo cirúrgico para expor o mediastino.
Corte o IVC e o esôfago diretamente acima do diafragma com micro tesoura. Remova o coração e os pulmões titulando-os para cima com fórceps segurando o IVC cortado e o esôfago e, em seguida, excisá-los com micro tesouras da base para ter acesso à aorta torácica e ao mediastino dorsal. Mobilize a aorta torácica de seu tecido circundante, retirando o tecido conjuntivo circundante e a gordura com fórceps finos, tomando cuidado para não danificar nenhuma artéria intercostal.
Cauterize todos os ramos da aorta torácica com fórceps cautery bipolares e extirpe o segmento aórtico entre o diafragma e o arco aórtico usando micro tesoura. Lave o segmento aórtico excisado com soro fisiológico heparinizado com uma agulha calibre 30, tomando cuidado para não danificar as paredes do vaso para remover qualquer sangue ou coágulos restantes e transferir o enxerto para o animal receptor. Puxe a extremidade proximal do segmento aórtico do doador sobre o manguito proximal em cima da artéria carótida invertida com fórceps finos e fixe-o imediatamente com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado.
Apare a extremidade livre distal do enxerto aórtico com micro tesoura para que o comprimento do enxerto se encaixe na distância entre as duas algemas. Puxe a extremidade distal do segmento aórtico do doador sobre o manguito distal em cima da artéria carótida invertida com fórceps finos e fixe-o imediatamente com um laço de seda 7-0 vagamente pré-amarrado. Remova primeiro o grampo distal para permitir a perfusão retrógrada.
Após atingir a hemostasia, remova o grampo proximal para completar a anastomose. Por fim, feche a ferida com sutura contínua de 6-0. Após 28 dias, os animais são sacrificados e os enxertos preservados para coloração histológica.
Como mostrado nestes furos de Van-Gieson de seções aórticas, as aortas alografadas totalmente mhc incompatíveis de doadores balb/c para seis receptores pretos desenvolveram uma hiperplasia neointimal significativa resultando em estreitamento luminal. Por outro lado, transplantes aórticos síngênicos de seis doadores negros para seis receptores negros desenvolveram apenas pouca hiperplasia neointimal. A coloração da imunofluorescência contra o SM22, um marcador para células musculares lisas vasculares, como mostrado neste quadro em fluorescência verde, demonstra que o neointima consiste principalmente de células musculares lisas vasculares.
O transplante aórtico murina serve como modelo para vasculopatia de transplante crônico que é a causa mais comum de falha tardia do enxerto. Em comparação com o modelo abdominal ortotópico, nossa técnica de manguito modificado é menos microcirúrgica exigindo uma alta taxa de sucesso. Além disso, devido ao diâmetro constante da braçadeira, variações da anastomose vascular vistas em outros modelos de transplante microcirúrgico podem ser negligenciadas.
Além disso, o tempo isquêmico quente é mantido constante em todos os grupos experimentais, à medida que o animal receptor é preparado primeiro antes do segmento aórtico ser explantado. Nosso modelo modificado deve ajudar outros laboratórios a estabelecer transplantes aórticos murinas.
