This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Preparação dos Reagentes <ol><li> Preparar tampão de agregação (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Armazenar à temperatura ambiente, estável por meses. Suplemento 1 mM de ditiotreitol (DTT) antes da utilização. NOTA: um tampão à base de HEPES (HEPES 10 mM, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) também produz resultados semelhantes em agregação de tau. </li><li> Prepare tioflavina T ou S tioflavina solução estoque (3 mM, dissolvido em tampão de agregação), e um filtro de 0,22 um por unidade de filtro estéril. Armazenar a -20 ° C em um tubo coberto por folha de alumínio, estável durante meses. </li><li> Preparar a solução de heparina (300 uM, dissolvidos em tampão de agregação). Armazenar a -20 ° C, estável durante meses. </li><li> Prepare ditiotreitol (DTT) estoque (1 M, dissolvido em água). Alíquota em tubos de 1,5 ml. Armazenar a -20 ° C. Antes de ensaios de agregação, descongelar a solução a 1 M à temperatura ambiente. A partir deste 1.000x estoque, prepare uma alíquota de 100 mM estoque que trabalham com água deionizada. Deixar no geloaté que esteja pronto. </li><li> Remover tau a partir de -80 ° C congelador. Descongele no gelo. Ajustar a concentração predeterminada de tau com o tampão de agregação. Centrifugação numa microcentrífuga a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C para remover grandes agregados pré-formados. Este passo de pré-fiação aumenta a consistência da medição da fluorescência de cada lote subsequente da preparação de proteína. Transferir o sobrenadante para outro tubo; deixar no gelo até que esteja pronto para montar a reação de agregação. </li></ol> 2. Não-dye, Ensaio Terminal NOTA: A reacção de agregação deste ensaio é realizado na ausência do corante fluorescente. Depois de misturar todos os componentes, a reacção é deixada prosseguir a pontos de tempo pré-determinados. As aliquotas são então retiradas da reacção de agregação e misturado com ThT ou THS para a ligação antes da leitura da fluorescência amilóide. O volume inicial da reacção de agregação depende do número de pontos de tempo necessários. Esta abordagem pode require uma grande quantidade de proteína tau, mas é rápido, simples, e pode ser feito de um fluorímetro ou um leitor de placa de multi-poços (ver discussão). Abaixo está o funcionamento passo-a-passo, usando o ISA SPEX FluoroMax-2 espectrofluorómetro compacto para quantificação de fluorescência. <ol><li> Defina-se a mistura de agregação em tubos de 1,5 ml de Eppendorf como na Tabela 1. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 100 ul, o que é suficiente para uma medição de ponto de momento. Ajuste a quantidade de todo o mix de agregação com base nos pontos de tempo necessário para a experiência particular. Adicionar adicional de 10% de cada componente para dar espaço para a pipetagem erro. A reacção contendo heparina típica mostrada aqui pode ser substituído por ácido araquidónico ou tampão de agregação. Adicionar DTT a 1 mM à mistura de reacção. Se toda a reacção demora mais do que um dia, complementar fresco todos os dias DTT (1 mM) para garantir um ambiente redutor. </li><li> Inverter o tubo algumas vezes para misturar. Place cada reacção numa incubadora de água ou banho de 37 ° C. A agitação não é necessária para a agregação de tau. </li><li> Antes de medir a fluorescência, ligue o espectrofluorómetro (lâmpada em primeiro lugar, em seguida, computador). NOTA: A lâmpada de arco de xenon que pode ser utilizado de imediato. No entanto, para obter melhores resultados permitem que a máquina aquecer por cerca de 10 min antes da leitura de fluorescência. </li><li> Inicie o software no computador. <ol><li> Escolha o modo de visualização em tempo real em Instrument Control Center, definir comprimento de onda de excitação de 450 nm (fenda de 2 nm) e comprimento de onda de emissão de 510 nm (fenda de 5 nm). Fechar a janela Modo de exibição Tempo real para retornar ao Centro de Controle de Instrumento. </li><li> Escolha Constante chave Análise Wavelength, prima Add &gt;&gt; na estrutura superior para adicionar conjuntos de comprimentos de onda. Defina os parâmetros de aquisição de erro padrão para 1 e Trials máxima a 3, em seguida, clique em Adicionar. Clique em Go! Para abrir a tela de dadosjanela. </li><li> Na janela exibir os dados, clique em Iniciar Acq para abrir a caixa de diálogo Sample Novo. Escolha &quot;desconhecido&quot; para o tipo de amostra. </li></ol></li><li> Para cada mistura de agregação de 100 ul, adicionar 98 ul de tampão de agregação e 2 ul de 3 mM de tioflavina T. pipeta várias vezes para misturar. </li><li> Transfira a totalidade da mistura a uma cuvete (FCA3, dimensão exterior, CxLxH = 12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm). Coloque a cuvete no porta-amostras em compartimento de amostra a e feche a tampa. Clique em Executar para coletar os dados de fluorescência. Grave os dados. </li><li> Retirar a cuvete e decantar a solução. Lavar o cadinho por água destilada 3 vezes. Dry, soprando ar para dentro e fora da tina. </li></ol> 3. Com-dye, Modo contínuo Assay num leitor de placas SpectraMax M2 NOTA: Este ensaio difere do anterior em que o corante fluorescente ou ThT THS está incluído no aggregareação ção. Isto permite a medição contínua do mesmo conjunto de reacções. Devido à utilização repetitiva de reacção, este método é melhor feita com um leitor de placas multi-poços automática (como mostrado a seguir a operação de SpectraMax M2). A fluorometer regular também funciona, mas a freqüência de medição de reações rápidas de agregação é um pouco limitado, devido à natureza manual da operação. <ol><li> Defina-se a mistura de agregação em uma placa de 96 poços (placa de 96 poços preta sólida, bem volume de 360 ul, fundo plano) como na Tabela 2. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 200 ul, o que é suficiente para uma medição do tempo de ponto. Misture bem por pipetagem várias vezes. Suplemento 1 mM de DTT fresco todos os dias ao longo do decorrer de experiências. </li><li> Incubar a placa de 96 poços a 37 ° C. </li><li> Em cada ponto de tempo, antes da medição de fluorescência, ligar o leitor de microplacas multi-modo e ao computador. Dê tempo suficiente para o machine a se estabilizar, cerca de 10 min. </li><li> Inicie o software no computador. Ajuste da temperatura a 37 ° C e escolher o modo de intensidade de fluorescência (FI-Top Ler), definido pelo comprimento de onda de excitação de 450 nm e comprimento de onda de emissão a 510 nm. </li><li> Insira a placa de 96 poços na gaveta e pressione a tecla de leitura para iniciar a medição. </li><li> Após a leitura, retire a placa e devolvê-lo de volta para o 37 ° C incubadora. Copie os dados e cole em uma planilha do Excel para análise de dados e plotagem. </li></ol> 4. Com-dye, Modo contínuo Ensaio sobre uma Espectrofluorímetro Compact <ol><li> Defina-se a mistura de agregação em tubos de 1,5 ml de Eppendorf como na Tabela 3. Cada coluna representa os ingredientes necessários para uma reacção de 200 ul, o que é suficiente para uma medição de ponto de momento. </li><li> Inverter o tubo algumas vezes para misturar. </li><li> Ligue o espectrofluorómetro e definir o software como nos passos 2.3 e 2.4. </li><li> Transferir toda a mistura toa cuvete. Coloque a cuvete no porta-amostras em compartimento de amostra a e feche a tampa. Clique em Executar para coletar os dados de fluorescência. Grave os dados. </li><li> Continue lendo a intervalos apropriados, clicando em Executar e gravar os dados. Se a agregação é para ser monitorizada, com uma frequência elevada (por exemplo, todos os 30 ou 60 seg), deixar a reacção na cuvete e na máquina até que a medição está concluída, ou quando não há tempo suficiente para trocar reacções ou cuvetes. </li><li> Retirar a cuvete e decantar a solução. Lavar o cadinho por água destilada 3 vezes. Dry, soprando ar para dentro e fora da tina. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Este protocolo demonstra diferentes condições e instrumentos que detectam as tau rápida cinética de agregação dependente da fosforilação de ensaio. No ensaio de terminal, o corante de fluorescência ThT é adicionada a uma porção da reacção foi removida a partir da mistura principal em cada ponto de tempo. Amilóide A ligação induzida por fluorescência é então medida 26. Na segunda, com corante modo, a agregação tau é levada a cabo na presença de ThT ou THS, tornando este tipo de reacçã...

Doença de Alzheimer (DA) é uma de uma grande colecção de desordens neurodegenerativas conhecidos como tauopatias. O tauopathy patologia de base por excelência é os emaranhados neurofibrilares, NFTs, nos neurônios, astrócitos e microglia 1-4. A densidade NFT se correlaciona com comprometimento cognitivo 3,5 e neurônio perda 6. NFT contém proteína tau hiperfosforilada principalmente (referido como &quot;p-tau&quot; daqui em diante), que forma filamentos helicoidais emparelhados (linear ou APC) 7,8. Tau é uma proteína associada à microtúbulos pensado para facilitar o transporte axonal, que é essencial para a sinalização neuronal e tráfico de 9,10. Cada molécula de tau contém 2 a 3 fosfatos em cérebro normal, mas o conteúdo de fosforilo aumenta em várias dobras em pacientes taupatia 11. Várias cinases são susceptíveis de contribuir para a tau hyperphosphorylation incluindo GSK3β (glicogênio sintase-quinase 3β) e CDK5 (ciclina-dequinase pendente 5) 12,13, mas o gatilho direto para a fosforilação patológica permanece indefinida 14. Fosforilação anormal em ou perto dos motivos de ligação de microtúbulos dissocia tau do microtúbulos 15, e faz com que tau mis-localização para o compartimento somatodendrítico, onde p-tau oligomerizes em filamentos helicoidais retas ou emparelhados que pode, eventualmente, polimerizam em inclusões NFT. A relação estreita hyperphosphorylation tau, formação NFT, e neurodegeneração levou a uma hipótese prevalente de que emaranhados p-tau extrair respostas citotóxicas apoptóticos e outros, e, portanto, é a causa subjacente para tauopathy neurodegeneração 16,17. Telas de drogas e testes clínicos iniciais com base nesta premissa, foram lançados 18. No entanto, esta hipótese enfrenta desafios 19,20. Por exemplo, SantaCruz et al., Mostraram que as funções cognitivas de ratinhos transgénicos pode ser melhorada através da supressão da expressão de um mutantetau humana, embora NFTs continuou a formar a partir de moléculas de tau existentes 21. Em um modelo de Drosophila, NFT foi mostrado para sequestrar a proteína tau citosólica tóxico para proteger as células neuronais subjacentes 22,23. Claramente, o papel patogénese de NFT, se houver, serão de grande impacto no sentido do desenvolvimento de agentes terapêuticos taupatia. Em concentrações elevadas, a proteína tau recombinante de cérebro normais ou espontaneamente, mas lentamente polimeriza numa estrutura semelhante a PHF in vitro, tal como indicado pela ligação de vários corantes β folhas preferidos fluorescentes, microscopia electrónica, e espectroscopia de dispersão de luz 24-27. Adicionando heparina ou ácido araquidônico, um ácido graxo abundante no cérebro humano, acelera drasticamente a formação de PHF em isoform- tau e indutor dependentes da concentração maneiras 28-32. Curiosamente, tau hyperphosphorylated purificada a partir de cérebros AD ou preparados por exaustiva em reações de fosforilação in vitro umggregates mais rápida e eficiente 26,33-35. Estes resultados estão em concordância excelente com os papéis patológicos de p-tau. Um sistema in vitro baseado na agregação de p-tau pode, assim, servir como uma ferramenta poderosa para o rastreio de drogas AD. Dada a estreita associação entre a agregação tau ea neurodegeneração progressiva da AD, bem como o recente fracasso no desenvolvimento de medicamentos visando a placa de Ap, outro marcador histológico chave de AD 36-38, o interesse em descobrir medicamentos que controlam a agregação tau está subindo. De facto, vários grupos começaram já telas de droga no caudal diferente, utilizando, em reacções de agregação de tau in vitro como o ensaio primário. Uma série de compostos exibiram actividades inibitórias sobre a agregação de reversão ou a tau in vitro 39-42. No entanto, todas as telas atuais regulador agregação tau tau usar inalterado que erra o alvo patológica chave de fósforoylation, levantando uma preocupação para a especificidade e eficácia da utilização destes compostos no tratamento AD. Um dos principais obstáculos para desenvolver ensaios de agregação para caracterização bioquímica e rastreio de drogas AD é a produção de quantidades suficientes de proteína tau hiperfosforilada patofisiologicamente relevantes. Usando o sistema de Catálise Zippers assistidas em que a isoforma 1N4R de tau e da quinase GSK-3β são co-expressos em E. coli como proteínas de fusão de fecho de leucina, temos que superar esse desafio (. Sui et al, submetido; veja a Figura 1 para os produtos finais de tau e p-tau; veja também 43 para caracterização de espectrometria de massa preliminar do p-tau). A partir de um painel de nove anticorpos específicos para diferentes locais de fosforilação de tau, sinais positivos foram observados em oito posições (dados não mostrados). A seguir, descrevemos os protocolos e instrumentações que podem diferenciar a agregação d cinéticaIFERENÇAS entre espécies de tau não modificado e p-tau. Estes ensaios foram modificados a partir de protocolos publicados que mediram o aumento da fluorescência de tioflavina T (ThT) ou tioflavina S (THS) sobre amilóides (agregados tau) vinculativo 26. No primeiro &quot;terminal&quot;, abordagem sem corante, reacções de agregação são montados e incubadas na ausência do corante amilóide. Em diferentes pontos de tempo, uma aliquota de cada reacção é removido e misturado com um volume igual de tampão de ThT contendo a parar a agregação e permitir ThT para ligar agregados tau. A fluorescência é medida por um IAP FluoroMax-2 fluorómetro. Na segunda &quot;com corante&quot; ensaio de monitorização contínua, ThT ou THS está incluído nas reacções de agregação. A fluorescência pode ser medida de forma contínua ao longo de toda a experiência manualmente ou utilizando um leitor de placas múltiplas. Além disso, descreve-se um ensaio que utiliza uma concentração quase fisiológica de tau e p-tau para a agregação na mo medição contínuade. O efeito de fosforilação permanece facilmente detectável. A seguir, vamos descrever os procedimentos passo-a-passo da operação, e mostrar resultados representativos destes ensaios. Discussão de alguns dos prós e contras de cada abordagem, bem como potenciais aplicações de rastreio de drogas vai seguir. Numa elevada concentração, a tau se agrega em estruturas amilóides como espontaneamente. No entanto, no laboratório, tau fibrillization é tipicamente acelerada por indutores tais como heparina (peso molecular médio, 6.000 g / mol) e ácido araquidónico. Exemplos aqui apresentados incluem 30? M de heparina. A formação de agregados amilóides tau é monitorizada pela fluorescência resultante da sua ligação por tioflavina T (ThT) ou tioflavina S (THS) amilóide. Após a ligação aos agregados de tau, ThT exibe um desvio para o vermelho de fluorescência (excitação: 450 nm; emissão de pico: 485 nm). THS, por outro lado, tem fraca emissão a 510 nm (excitação a 450 nm) antes da ligação de amilóide, mas este fluorescence aumenta significativamente na presença de uma proteína amilóide, tais como a tau agregada 44. Ambos os corantes funcionam bem na detecção de tau e p-tau agregação. Devido à forte pico de emissão relativamente amplo e de ThT (ver Figura 2), existe apenas 30% de redução na unidade de fluorescência a 510 nm. Por conveniência, utilizar a mesma combinação de comprimentos de onda de excitação / emissão (isto é, 450 nm / 510 nm), para controlar a agregação tau quando utilizado um ou corante. Agregação de tau pode ser realizada na presença ou ausência do corante, dependendo do objetivo do ensaio e a disponibilidade da proteína tau. Ambos os modos de reacções são apresentados abaixo. Além disso, podemos demonstrar o funcionamento de dois instrumentos diferentes - um fluorometer single-amostra (ISA-SPEX FluoroMax-2) e um leitor multi-plate (SpectraMax M2). Os leitores devem ser capazes de se adaptar estes protocolos para atender às suas necessidades específicas e disponibilidade de instrumentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Usando tau recombinante e p-tau (Figura 1), que estabeleceu dois protocolos diferentes para comparar a cinética de agregação de tau e p-tau, aproveitando a forte emissão de fluorescência de ThT e THS por ligação a agregados de proteína amilóide, incluindo tau e p-tau (Figura 2). Com ou sem o corante fluorescente na reacção de agregação, observou-se aumento consistente de agregação de tau por hiperfosforilação (Figuras 3-5). Esta estimulação é indepen...

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Proteínas tau não modificados e hiperfosforiladas foram utilizados em dois ensaios in vitro de agregação para revelar a cinética de agregação rápida dependente de hiperfosforilaï¿½o. Estes ensaios pavimentar o caminho para futuras telas para os compostos que podem modular a propensão de tau hyperphosphorylated para formar fibrilas que fundamentam a progressão da doença de Alzheimer.

In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.3K visualizações.  Michigan State University.  Proteínas tau não modificados e hiperfosforiladas foram utilizados em dois ensaios in vitro de agregação para revelar a cinética de agregação rápida dependente de hiperfosforilaï¿½o. Estes ensaios pavimentar o caminho para futuras telas para os compostos que podem modular a propensão de tau hyperphosphorylated para formar fibrilas que fundamentam a progressão da doença de Alzheimer. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Coloração de proteínas em géis com Coomassie G-250 sem ácido acético e Solventes Orgânicos

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detecção rápida de Homogêneos Ensaios Biológicos Usando o sistema de modulação Biossensoriais Magnetic

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Análise de Schwann-astrócito Interações Usando In Vitro Ensaios

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with good spatial and temporal resolution. Here we describe how to perform FRAP and FLIP assays of chromatin proteins, including H1 and HP1, in mouse embryonic stem (ES) cells. In a FRAP experiment, cells are transfected, either transiently or stably, with a protein of interest fused with the green fluorescent protein (GFP) or derivatives thereof (YFP, CFP, Cherry, etc.). In the transfected, fluorescing cells, an intense focused laser beam bleaches a relatively small region of interest (ROI). The laser wavelength is selected according to the fluorescent protein used for fusion. The laser light irreversibly bleaches the fluorescent signal of molecules in the ROI and, immediately following bleaching, the recovery of the fluorescent signal in the bleached area - mediated by the replacement of the bleached molecules with the unbleached molecules - is monitored using time lapse imaging. The generated fluorescence recovery curves provide information on the protein's mobility. If the fluorescent molecules are immobile, no fluorescence recovery will be observed. In a complementary approach, Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP), the laser beam bleaches the same spot repeatedly and the signal intensity is measured elsewhere in the fluorescing cell. FLIP experiments therefore measure signal decay rather than fluorescence recovery and are useful to determine protein mobility as well as protein shuttling between cellular compartments. Transient binding is a common property of chromatin-associated proteins. Although the major fraction of each chromatin protein is bound to chromatin at any given moment at steady state, the binding is transient and most chromatin proteins have a high turnover on chromatin, with a residence time in the order of seconds. These properties are crucial for generating high plasticity in genome expression1. Photobleaching experiments are therefore particularly useful to determine chromatin plasticity using GFP-fusion versions of chromatin structural proteins, especially in ES cells, where the dynamic exchange of chromatin proteins (including heterochromatin protein 1 (HP1), linker histone H1 and core histones) is higher than in differentiated cells2,3.

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

We describe photobleaching methods including Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) to monitor chromatin protein dynamics in embryonic stem (ES) cells. Chromatin protein dynamics, which is considered to be one of the means to study chromatin plasticity, is enhanced in pluripotent cells.

Fotobranqueamento Ensaios (FRAP &amp; FLIP) a Medida Dynamics Protein Chromatin em Viver Células-Tronco Embrionárias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Formação de imagens 4D de agregação de proteínas em células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Ensaios para Monitoramento juntamente redobramento de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Na migração celular in vitro e invasão Ensaios

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

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