Um dos mecanismos propostos pelos quais os anticorpos terapêuticos anti-Tau reduzem a patologia na doença de Alzheimer é a absorção no despejo do antigo Tau agregado patológico pela microglia. Aqui, apresentamos o ensaio da base celular para avaliar a absorção de Tau por microglia. Este ensaio representa uma ferramenta investigativa útil para caracterizar melhor o mecanismo de ação dos anticorpos anti-Tau.
No primeiro dia do experimento, prepare as células BV-2 lavando-as primeiro com 1x PBS no frasco em que foram cultivadas. Em seguida, incuba-os com 05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius e 5%C02 até que eles se desprendem do frasco. Suspenda as células em meio de cultura, subindo e descendo três a cinco vezes.
Conte células e prepare uma suspensão celular com uma concentração final de 100.000 células por mililitro em meio de cultura contendo 200 microgramas por mililitro heparina. Adicione 250 microliters desta suspensão celular por poço em uma placa de fundo plana de cultura de tecido de 96 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5%C02, durante a noite.
Depois de descongelar agregados de pH dye-Tau previamente preparados no gelo, dilui-os em 65 microliters por condição de meio livre de soro, para fazer uma solução de 500 nanomolar. Anticorpos diluídos em 65 microliters de meio livre de soro para alcançar o dobro da concentração desejada. Misture agregados e anticorpos pH dye-Tau em uma placa de fundo U de 96 bem.
Sele esta placa de diluição e incuba durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte remova o meio da placa 96 com células BV-2. Lave as células em cada poço com 100 microliters de temperatura ambiente 1x PBS.
Remova o PBS da placa da célula BV-2. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microliters de complexos amino da placa de diluição para cada poço de uma placa celular BV-2 de 96 poços, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius com 5%de CO2. Após a incubação, remova os complexos de amino das células e lave as células em cada poço com 100 microliters de temperatura ambiente 1x PBS.
Depois de remover o PBS 1x adicione 50 microlitadores de 25% de trippsina EDTA e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5%de CO2. Depois disso, adicione 200 microliters de meio de cultivo e suspenda o poço por tubulação para cima e para baixo para desacoplar as células. Transfira as células para uma placa de fundo U de 96 poços e centrífugas a 400 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius.
Coloque a placa no gelo e retire o meio. Adicione 150 microliters de gelo frio 1x PBS e centrífuga novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Coloque a placa no gelo e lave novamente removendo previamente adicionado 1x PBS e adicionando 150 microliters de PBS gelado por poço.
Centrífuga novamente sob as mesmas condições. Coloque a placa no gelo e lave as células removendo o PBS adicionado anteriormente e adicionando 150 microliters TAMPÃO FACS por poço. Centrífuga novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.
Coloque a placa no gelo e remova o buffer FACS adicionado anteriormente e suspenda as células em 200 microliters TAMPão FACS por poço. Imediatamente proceder à análise pela FACS para adquirir 20.000 eventos no portão da cela ao vivo. Para análise FACS use a área de dispersão dianteira ou área de dispersão lateral ou área de dispersão lateral ou inclinação de densidade SSCA para portão em células vivas, excluindo eventos com níveis de dispersão para a frente mais baixos, como detritos e células mortas.
Em seguida, dentro da população de células vivas use FSCA versus altura de dispersão para a frente ou FSCH para criar um portão singlet e excluir duplos e agregados de células. Em seguida, use os eventos no portão singlet para gerar um histograma de um parâmetro único de corante pH. Use o histograma gerado para primeiro determinar a intensidade média da fluorescência.
Depois disso, determinamos a porcentagem de células positivas de pH dye-Tau, excluindo células negativas como determinado usando o único controle do BV-2. Os anticorpos CBTau-28.1 promovem uma absorção de Tau em células BV-2 de forma dependente, como mostrado pela citometria de fluxo. O duplo mutante cbtau-28.1 anticorpos mediados tau absorção nas células BV-2 em maior grau do que o anticorpo tipo selvagem.
Os fragmentos de FAB CBTau-28.1 não aumentaram a absorção basal de Tau indicando um mecanismo de internalização mediada pelo receptor FC. A microscopia confocal confirmou o aumento mediado de anticorpos da absorção de Tau. Corante de pH verde rotulado tau agregados muitas vezes co-localizados com cortiça vermelha lysotracker manchada organelas ácidas, sugerindo assim a presença de agregados tau em um compartimento endolísomal.
CBTau-28.1 Os fragmentos fab não aumentaram novamente a absorção de Tau indicando que a captação foi de fato mediada pelo FC. O ensaio que acabamos de descrever nos permite quantificar especificamente a absorção de anticorpos mediados por microglia. Os dados gerados com este ensaio podem ajudar a elucidar o mecanismo de ação dos anticorpos anti-Tau, representando assim uma ferramenta útil para avançar os anticorpos anti-Tau para avançar em seu desenvolvimento como potencial tratamento da DA.
