Assim, nosso protocolo nos permite preparar ácidos graxos epóxi, e este método pode ajudar a avançar na pesquisa sobre os mecanismos pelos quais esses metabólitos atuam no corpo. Historicamente, ácidos graxos epóxi puros são muito difíceis de obter. Então nosso protocolo é simples, rápido, econômico, e nos permite preparar quantidades significativas desses metabólitos.
Sim, desenvolvemos um protocolo para DHA, mas também funciona muito bem para EPA e ácido aracidônico. Trabalhe rapidamente, pois alguns dos reagentes são sensíveis ao ar, especificamente DHA e NADPH, e certifique-se de emparelhar tudo com antecedência para que a configuração seja simples. Além disso, esteja ciente dos perigos.
Nosso protocolo utiliza técnicas em enzima e química orgânica. A visualização é fundamental para ajudar leitores e espectadores que não estão familiarizados com as técnicas especializadas nesses campos. Para inocular, use um laço estéril ou pipeta mergulhado em estoque de glicerol de pBS-BM3 transfectado DH5-alfa E.coli em cinco mililitros de caldo LB estéril suplementado com 0,5 miligramas de ampicilina.
Incubar a cultura celular em um shaker a 37 graus Celsius por 24 horas a 200 rpm. Em seguida, adicione a cultura inicial de cinco mililitros e 100 miligramas de ampicilina a um litro de caldo LB estéril em um frasco Erlenmeyer. Agite a 37 graus Celsius por seis horas a 200 rpm, depois a 30 graus Celsius por 18 horas a 200 rpm.
Depois disso, colete a cultura celular em tubos de centrífuga, e centrifugar a cultura celular a quatro graus Celsius por 10 minutos a 1.000 vezes g. Despeje o supernatante em outro frasco. Descontaminar com alvejante ou usando a autoclave, e armazene a pelota da célula a menos 78 graus Celsius até a purificação da enzima.
Para realizar a lise celular, primeiro descongele a pelota celular no gelo, e resuspend em 40 mililitros de tampão de solubilização gelada contendo Tris, PMSF e EDTA. Enquanto no gelo, sonicate as células por um minuto com um homogeneizador ultrassônico, com uma configuração de potência de saída de 10 e dever de 100, seguido por uma quebra de um minuto no gelo, a fim de lise as células. Repita este procedimento seis vezes.
Centrifugar a célula lysate a quatro graus Celsius por 30 minutos a 11.000 vezes g para pelotar os detritos celulares. Para realizar cromatografia de afinidade, em uma sala fria ou geladeira com uma porta deslizante, a quatro graus Celsius, primeiro prepare uma forte coluna de cromatografia de troca de ânion lavando a resina com cinco volumes de coluna de tampão A de Tris de 10 mililitros no pH 7.8. Em seguida, adicione o supernatante das células à coluna equilibrada, e lave a coluna com três volumes de coluna de tampão frio A.Em seguida, elute o BM3 lavando a coluna com seis volumes de coluna de tampão frio B de Tris 10-mililitro e cloreto de sódio de 600 mililitros.
Colete a fração de eluente marrom-avermelhado. Se a proteína não estiver sendo usada imediatamente, misture-a com um volume igual de glicerol e congele com nitrogênio líquido. Armazene a solução congelada a menos 78 graus Celsius.
Para realizar a epóxida de DHA, primeiro determine a concentração da enzima BM3 descongelada, de acordo com o método de ensaio espectral de monóxido de carbono. Em seguida, em um béquer contendo dois litros de tampão de reação sendo agitado em uma placa de agitação magnética, adicione 0,94 mililitros de DHA diluídos em 18,8 mililitros de DMSO e a enzima BM3 diluída para 20 nanomolar. Enquanto a solução está mexendo, comece a reação de epóxida adicionando 8,7 mililitros de tampão de reação contendo 0,94 mililitros de NADPH.
Mexa a reação por 30 minutos enquanto borbulha o ar na mistura de reação com um balão cheio de ar preso a uma seringa e agulha colada no interior do béquer. Depois disso, elasenhe um microliter da mistura de reação e coloque-o em um espectrômetro NanoDrop para medir a absorvância em 340 nanômetros. Use a água como em branco.
Se não houver absorção restante, o que indica que o NADPH foi consumido, a reação está completa. Sacie a mistura de reação adicionando lentamente um molar ácido oxálico dropwise, até que o pH da solução atinja aproximadamente quatro. Agora, extraia a solução tampão saciada com dois litros de éter dietil anidro e livre de peróxido.
Use um funil separador para agitar e separar as camadas, e colete o éter em um frasco de Erlenmeyer. Repita duas vezes adicionais e adicione aproximadamente 50 gramas de sulfato de magnésio anidro para secar o éter. Em um funil de filtro de vácuo, despeje o éter seco para filtrar o sulfato de magnésio e transfira a camada de éter filtrada para um frasco de fundo redondo do evaporador rotativo.
Ajuste a velocidade de rotação para médio e inicie o vácuo para concentrar o líquido para produzir resíduos brutos de EDP. Carregue o resíduo em um cartucho de sílica de 40 gramas para realizar a cromatografia da coluna flash usando uma máquina automatizada de purificação de flash. Comece com acetato de 10% de etila em hexanos, e aumente até 60% de acetato etílico em hexanos ao longo de 22 minutos.
As frações são coletadas automaticamente em tubos. Em seguida, misture as frações de cada pico em um frasco de fundo redondo, coloque o evaporador rotativo e inicie a evaporação. Três frações são obtidas, DHA, isômeros EDP e diepoxide.
Para esterify os 0,151 gramas de epóxi, em um frasco de fundo redondo ou frasco pequeno, adicione dois mililitros de metanol anidro e três mililitros de tolueno anidro, e adicione uma barra de agitação. Conecte o frasco com um balão cheio de argônio através de um septo de borracha e uma agulha, e adicione 0,26 mililitros de tms-diazometano de dois molares através de uma seringa enquanto mexe. Espere 10 minutos e adicione 05 mililitros adicionais de TMS-diazometano até que uma cor amarela pálida apareça.
Após 30 minutos, concentre cuidadosamente a mistura usando o evaporador rotativo e use um cartucho de coluna de gel de sílica de 40 gramas na máquina de cromatografia flash para purificar o resíduo. Eluto com uma concentração isocrática de acetato de 4% de etila em hexanos ao longo de 22 minutos. Recolher as frações contendo o éster de metila purificado 19S, 20R-EDP eluates primeiro, seguido por 16S, 17R-EDP metil ester.
Agora, avalie as frações por cromatografia de camada fina em uma mistura de hexano-a-etil-acetato de oito para um. Mancha com permangênio de potássio para verificar se há frações mistas contendo ambos os isômeros. Concentre as frações correspondentes a cada pico em um evaporador rotativo e, em seguida, pese sobre um equilíbrio para determinar a quantidade de ésteres EDP obtidos.
Se permanecerem frações mistas, re-cromatógrafo-as com o mesmo sistema de solvente que anteriormente utilizado. Concentre cada fração contendo o regioisômero individual em um evaporador rotativo. Para converter regioisômeros individuais de metila metil edp em suas formas ácidas, diluir o éster EDP em um pequeno frasco com aproximadamente 0,7 mililitros de THF por 0,1 milimoles de éster, juntamente com 0,175 mililitros de água.
Esfrie o frasco a zero graus Celsius em um banho de gelo, adicione três equivalentes da solução de hidróxido de lítio e mexa em uma placa de agitação sob argônio durante a noite enquanto aquece à temperatura ambiente. Pela manhã, sacie a reação adicionando lentamente ácido fórmico, até que o pH da mistura atinja de três a quatro. Em seguida, adicione água e dois mililitros de acetato etílico para separar as camadas.
Extrair a camada de água com 10 mililitros de acetato etílico três vezes, lavar com 20 mililitros de solução de salmoura saturada e adicionar vários gramas de sulfato de sódio anidro na solução para secar a camada de acetato etílico. Concentre a solução de acetato etílico usando o evaporador rotativo, adicione 10 mililitros de hexanos e concentre-se novamente. Repita duas vezes para remover azeotropicamente ácido fórmico residual.
Purifique o resíduo por cromatografia de coluna flash, eluindo com acetato de 10 a 30% de etila ao longo de 15 minutos. Concentre as frações desejadas no evaporador rotativo, e seque em vacuo para pagar o ácido purificado. O cromatograma da coluna flash obtido após a purificação da mistura bruta da epóxida enzimática é mostrado aqui.
Três picos principais foram obtidos, eluting na ordem de, primeiro, DHA não redigido, segundo, mistura de isômeros EDP, e, terceiro, diepoxide, que são produtos normais de super oxidação. Após a esterificação e separação dos regioisômeros, os espectros de nmr do próton indicam que foram obtidos estileiros de alta pureza 16S, 17R-EDP e 19S, 20R-EDP. Quiral HPLC confirmou pureza enantiomerica das formas ácidas dos EDPs.
Certifique-se de manter seu caldo estéril durante o manuseio e inoculação para evitar contaminação. A epóxidação pode ser usada para outros ácidos graxos. Então também tentamos com ácidos aracidonicos e eicosapentaenoicos, e obtivemos bons rendimentos desses epóxidos de inantiopure, então 14, 15-EET e 17, 18-EEQ.
Assim, um protocolo que permite aos pesquisadores acessar ácidos graxos epóxi pode ajudar na pesquisa sobre as funções biológicas desses compostos, o que poderia levar ao seu uso como chumbo medicamentoso. Os produtos químicos perigosos são o PMSF, que é perigoso pelo contato, e o TMS-diazometano, que é muito tóxico pelo contato e inalação. Assim, este último deve ser usado em um capô de fumaça e com equipamento de proteção individual adequado.
