A cardiografia elétrica in vivo é a única ferramenta de diagnóstico para fenotipagem elétrica em zebrafish vivo em estudos transversais e longitudinais. Nossa abordagem é prática, minimamente invasiva e econômica porque reutilizamos um sistema de aquisição de dados para mamíferos. Enfatizamos a estratégia de interpretação do ECG em tempo real para validação precoce da qualidade dos dados.
Como os ECGs humanos e zebrafish são semelhantes, a eletrocardiografia in vivo facilita o uso de zebrafish na modelagem da fisiologia cardíaca humana, bem como a triagem de medicamentos de alto rendimento para cardiotoxicidades, como a prolongamento do QT. O posicionamento correto do lead é a chave para o sucesso. Como a onda normal de zebrafish T é a menor, priorize a otimização de sua amplitude sobre as das ondas maiores P e R.
Estude padrões normais e patológicos de ECG para interpretar seus achados de ECG. Não dependa apenas da interpretação automática do software de análise ECG. No dia do experimento, transporte o zebrafish do aquário para o laboratório.
Para configurar o sistema de gravação in vivo ECG, conecte as peças essenciais do equipamento e insira os três eletrodos de aço inoxidável codificados por cores do chumbo ECG nos três portais de acesso combinados com cores do amplificador. Para a indução da anestesia nível 4, mergulhe um zebrafish adulto em um prato contendo uma solução de anestésicos nas concentrações pré-determinadas mais baixas aprovadas pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais. Uma vez que o zebrafish tenha mantido a anestesia nível 4 por três segundos, use um par de fórceps contundentes para transferir imediatamente o peixe para uma esponja úmida com uma superfície cortada e ventral para cima, para a colocação dos três eletrodos ECG.
Insira suavemente o eletrodo positivo na linha média ventral ao nível do bulbus arteriosus de um a dois milímetros acima de uma linha imaginária conectando as duas bordas inferiores dos operculums. Posicione o eletrodo negativo caudally e 0,5 a um milímetro deixado lateralmente para o eletrodo positivo a uma distância maior do que o comprimento máximo apicobasal do ventrículo de zebrafish adulto, em seguida, posicione o eletrodo de referência caudal perto da região anal. Para gravação de ECG, inicie o sistema e abra o programa de aquisição de dados ECG.
Selecione uma configuração desejada nos menus suspensos para intervalo, passe baixo e passe alto. Pressione Comece a iniciar a gravação contínua de ECG sem lacunas a uma taxa de amostragem de um quilohertz. Para otimizar o posicionamento do lead para a relação sinal-ruído máximo, pressione Pare para parar a gravação e revise o rastreamento logo após a primeira tentativa de gravação de cada coração.
Se o ECG for esperado para ser normal, confirme que todas as formas de onda ECG são distintas e facilmente visíveis e que a onda P, o complexo QRS líquido e a onda T são todos positivos. O passo mais crítico é o posicionamento de chumbo para maximizar a relação sinal-ruído. Aplique nossos quatro critérios de validação após a primeira tentativa de registro de ECG para que cada peixe obtenha feedback corretivo.
Se for esperado um ECG normal, reposicione os eletrodos conforme necessário até que todos esses quatro critérios de validação sejam satisfeitos. Se uma onda T normal for esperada, mas a onda T é muito pequena, reposicione os eletrodos para maximizar a amplitude da onda T. Retome a gravação do ECG depois de otimizar o posicionamento do lead, salvando as varreduras do ECG para análises subsequentes.
No final da sessão de gravação do ECG, remova cuidadosamente os eletrodos sem ferir o peixe. Em estudos de sobrevivência, transfira os peixes para água de peixe fresca e oxigenada livre de tricaine. Por favor, note que, neste vídeo, para facilitar a visualização dos leitores da recuperação de peixes da anestesia, a oxigenação é interrompida.
Para facilitar a recuperação da anestesia em estudos de sobrevivência, use uma pipeta Pasteur para esguichar vigorosamente água sobre as brânquias até que o peixe retome o movimento regular da brânquia ou natação, em seguida, monitore os peixes para recuperação total da anestesia antes de devolver o peixe ao aquário. O peixe é considerado totalmente recuperado da anestesia quando pode nadar ereto por pelo menos cinco segundos. Para definir as configurações de análise, abra o programa de análise de dados ECG e abra o arquivo ECG de interesse para exibir o traço completo do ECG.
Use o mouse para arrastar uma seção de interesse no rastreamento ECG para analisar. No menu Análise do ECG, selecione Configurações de ECG para abrir uma caixa de diálogo para pré-preparar várias configurações de parâmetros para análise automática de software. Analise o ritmo e a frequência cardíaca e determine se o ritmo cardíaco é sinuso ou não, regular ou irregular.
Para determinar a frequência cardíaca, certifique-se de que o software identifica corretamente todas as ondas P e R porque a taxa atrial e ventricular é baseada no intervalo PP e RR, respectivamente. Corrija quaisquer erros de identificação automática movendo os cursores extraviados para as ondas P e R apropriadas. Para calcular intervalos e durações de ondas, abra a análise do ECG e a visão média para concatenar vários ciclos cardíacos consecutivos em um único sinal médio.
Certifique-se de que o software identifica corretamente o início e o fim da onda P, o complexo QRS e a onda T, em seguida, mova os cursores extraviados para as posições apropriadas para corrigir quaisquer erros de identificação automática. Para exportar as medidas do ECG, selecione Table View para revisar todas as medições do ECG e copiar e colar as medidas de interesse em uma planilha para análise posterior. Para exportar um traço ECG, use a lupa para destacar uma seção de interesse na varredura e cópia do ECG e colar a varredura no documento desejado.
Em contrato com o coração humano, que tem dois atrias e dois ventrículos, o coração de zebrafish tem apenas um átrio e um ventrículo. Apesar de sua aparente simplicidade anatômica, o coração zebrafish compartilha várias características do ECG com o coração humano. A colocação adequada do chumbo requer alinhar o chumbo com o eixo principal cardíaco presumido.
Quando os eletrodos são inseridos superficialmente na dermis, o chumbo é considerado indireto e os sinais de tensão são pequenos. Quando os eletrodos são inseridos na profundidade de um milímetro apropriada na musculatura peitoral, o chumbo se torna semi-direto e os sinais de tensão aumentam. Se os eletrodos forem inseridos mais fundo do que um milímetro no ventrículo, no entanto, o chumbo se torna direto e os sinais de tensão aumentam ainda mais, com a amplitude da onda R aumentando em quatro vezes em comparação com quando os eletrodos são inseridos na profundidade apropriada.
O traço de ECG de eletrodos muito profundamente inseridos também revela novos sinais de lesão no miocárdio ventricular, como uma nova depressão st e uma nova inversão de ondas T. Se os eletrodos positivos e negativos forem trocados em sua colocação, inversões incomuns de todas as formas de onda ECG são observadas. Um nível inadequado de profundidade de sedação também pode prejudicar a qualidade da gravação in vivo do ECG.
Lembre-se de anestesiar profundamente o suficiente para imobilizar o peixe sem matá-lo. Posicione os eletrodos para maximizar a relação sinal-ruído e evite a dependência excessiva da análise automática do software. Seguindo este procedimento de sobrevivência minimamente invasivo, é possível realizar outros procedimentos como ablação parcial, ressecção do coração ou investigações de ECG em série em respostas a medicamentos ou estudos longitudinais.
Toxicidades sistêmicas são complicações potenciais de qualquer anestésico, incluindo tricaine. Essas toxicidades podem ser reduzidas capitalizando a sinergia de vários anestésicos para diminuir a dose de agentes individuais.
