La cardiografia elettrica in vivo è l'unico strumento diagnostico per la fenotipizzazione elettrica nel pesce zebra vivo negli studi trasversali e longitudinali. Il nostro approccio è pratico, minimamente invasivo ed economico perché riutilizzamo un sistema di acquisizione dati per i mammiferi. Sottolineiamo la strategia di interpretazione ECG in tempo reale per la convalida precoce della qualità dei dati.
Poiché gli ECG umani e zebrafish sono simili, l'elettrocardiografia in vivo facilita l'uso del pesce zebra nella modellazione della fisiologia cardiaca umana e lo screening dei farmaci ad alta produttività per le cardiotossicità, come il prolungamento del QT. Il corretto posizionamento dei lead è la chiave del successo. Poiché la normale onda T zebrafish è la più piccola, dare la priorità ottimizzando la sua ampiezza rispetto a quelle delle onde P e R più grandi.
Studia modelli ECG normali e patologici per interpretare tu stesso i risultati dell'ECG. Non fare affidamento esclusivamente sull'interpretazione automatica del software di analisi ECG. Il giorno dell'esperimento, trasporta il pesce zebra dall'acquario al laboratorio.
Per impostare il sistema di registrazione ECG in vivo, collegare i pezzi essenziali dell'apparecchiatura e inserire i tre elettrodi in acciaio inossidabile codificati a colori del piombo ECG nei tre portali di accesso abbinati al colore dell'amplificatore. Per l'induzione dell'anestesia di livello 4, immergere un pesce zebra adulto in un piatto contenente una soluzione di anestetici alle concentrazioni predeterminate più basse approvate dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Una volta che il pesce zebra ha mantenuto l'anestesia di livello 4 per tre secondi, utilizzare un paio di forcep smussate per trasferire immediatamente il pesce su una spugna umida con una fessura, superficie ventrale verso l'alto, per il posizionamento dei tre elettrodi ECG.
Inserire delicatamente l'elettrodo positivo nella linea mediana ventrale a livello del bulbus arteriosus da uno a due millimetri sopra una linea immaginaria che collega i due bordi inferiori degli opercoli. Posizionare l'elettrodo negativo caudally e da 0,5 a un millimetro lasciato lateralmente all'elettrodo positivo a una distanza maggiore della lunghezza apicobasale massima del ventricolo di zebrafish adulto, quindi posizionare l'elettrodo di riferimento caudally vicino alla regione anale. Per la registrazione ECG, avviare il sistema e aprire il programma di acquisizione dati ECG.
Selezionare un'impostazione desiderata dai menu a discesa per intervallo, passaggio basso e passaggio alto. Premere Start per avviare la registrazione ECG continua senza gap a una frequenza di campionamento di un kilohertz. Per ottimizzare il posizionamento del piombo per il massimo rapporto segnale-rumore, premere Interrompi per interrompere la registrazione e rivedere la traccia subito dopo il primo tentativo di registrazione per ogni cuore.
Se ci si aspetta che l'ECG sia normale, confermare che tutte le forme d'onda ECG sono distinte e facilmente visibili e che l'onda P, il complesso QRS netto e l'onda T sono tutti positivi. Il singolo passo più critico è il posizionamento del piombo per massimizzare il rapporto segnale-rumore. Applica i nostri quattro criteri di convalida dopo il primo tentativo di registrazione ECG per ogni pesce per ottenere un feedback correttivo.
Se è previsto un normale ECG, riposizionare gli elettrodi se necessario fino a quando non saranno soddisfatti tutti questi quattro criteri di convalida. Se ci si aspetta un'onda T normale, ma l'onda T è troppo piccola, riposizionare gli elettrodi per massimizzare l'ampiezza dell'onda T. Riprendere la registrazione ECG dopo aver ottimizzato il posizionamento del lead, salvando le sweep ECG per un'analisi successiva.
Al termine della sessione di registrazione ECG, rimuovere con cura gli elettrodi senza ferire il pesce. Negli studi di sopravvivenza, trasferire il pesce in acqua di pesce fresca e ossigenata priva di tricaina. Si prega di notare che, in questo video, per facilitare la visione da parte dei lettori del recupero del pesce dall'anestesia, l'ossigenazione viene interrotta.
Per facilitare il recupero dall'anestesia negli studi di sopravvivenza, utilizzare una pipetta Pasteur per spruzzare vigorosamente acqua sulle branchie fino a quando il pesce riprende il normale movimento branchiale o nuotare, quindi monitorare il pesce per il pieno recupero dall'anestesia prima di riportare il pesce all'acquario. Il pesce è considerato completamente recuperato dall'anestesia quando può nuotare in posizione verticale per almeno cinque secondi. Per definire le impostazioni di analisi, aprire il programma di analisi dei dati ECG e aprire il file ECG di interesse per visualizzare l'intera traccia ECG.
Utilizzare il mouse per trascinare una sezione di interesse nella traccia ECG da analizzare. Dal menu Analisi ECG selezionare Impostazioni ECG per aprire una finestra di dialogo per predefinire varie impostazioni dei parametri per l'analisi automatica del software. Analizzare il ritmo e la frequenza cardiaca e determinare se il ritmo cardiaco è seno o meno, regolare o irregolare.
Per determinare la frequenza cardiaca, assicurarsi che il software identifichi correttamente tutte le onde P e R perché la frequenza atriale e ventricolare si basa rispettivamente sull'intervallo PP e RR. Correggere eventuali errori di identificazione automatica spostando i cursori spostati sulle onde P e R appropriate. Per calcolare intervalli e durate delle onde, aprire l'analisi ECG e la vista media per concatenare diversi cicli cardiaci consecutivi in un unico segnale medio.
Assicurarsi che il software identifichi correttamente l'inizio e la fine dell'onda P, il complesso QRS e l'onda T, quindi spostare i cursori spostati nelle posizioni appropriate per correggere eventuali errori di identificazione automatica. Per esportare le misurazioni ECG, selezionare Visualizzazione tabella per esaminare tutte le misurazioni ECG e copiare e incollare le misure di interesse in un foglio di calcolo per un'analisi successiva. Per esportare una traccia ECG, utilizzare la lente di ingrandimento per evidenziare una sezione di interesse nella sweep ECG e copiare e incollare la sweep nel documento desiderato.
In contratto con il cuore umano, che ha due atri e due ventricoli, il cuore di zebrafish ha un solo atrio e un ventricolo. Nonostante la sua apparente semplicità anatomica, il cuore zebrafish condivide diverse caratteristiche dell'ECG con il cuore umano. Un corretto posizionamento del piombo richiede l'allineamento del piombo con il presunto asse principale cardiaco.
Quando gli elettrodi sono inseriti troppo superficialmente nel derma, il piombo è considerato indiretto e i segnali di tensione sono piccoli. Quando gli elettrodi vengono inseriti alla profondità appropriata di un millimetro nella muscolatura di pettorale, il piombo diventa semi-diretto e i segnali di tensione aumentano. Se gli elettrodi vengono inseriti più in profondità di un millimetro nel ventricolo, tuttavia, il piombo diventa diretto e i segnali di tensione aumentano ulteriormente, con l'ampiezza dell'onda R che aumenta di quattro volte rispetto a quando gli elettrodi vengono inseriti alla profondità appropriata.
La traccia ECG da elettrodi inseriti troppo profondamente rivela anche nuovi segni di lesione al miocardio ventricolare, come una nuova depressione ST e una nuova inversione dell'onda T. Se gli elettrodi positivi e negativi vengono commutati nel loro posizionamento, si osservano inversioni insolite di tutte le forme d'onda ECG. Un livello inappropriato di profondità di sedazione può anche compromettere la qualità della registrazione ECG in vivo.
Ricorda di anestetizzare abbastanza profondamente da immobilizzare il pesce senza ucciderlo. Posizionare gli elettrodi per massimizzare il rapporto segnale-rumore ed evitare un'eccessiva dipendenza dall'analisi software automatica. Seguendo questa procedura di sopravvivenza minimamente invasiva, è possibile eseguire altre procedure come ablazione parziale, resezione del cuore o indagini seriali ECG in risposte farmacologiche o studi longitudinali.
Le tossicità sistemiche sono potenziali complicanze di qualsiasi anestetico, compresa la tricaina. Queste tossicità possono essere ridotte capitalizzando la sinergia di anestetici multipli per abbassare la dose di singoli agenti.
