Nosso novo protocolo realmente nos permite visualizar estruturas celulares em 3D usando tomografia computadorizada de raio-x. E fazemos isso manchando tecido com eosina e dessa forma tornar o citoplasma visível. Além de aplicações médicas e pesquisas, também pensamos que nosso método pode ser aplicado em biologia como, por exemplo, pesquisa de zoologia ou biologia do desenvolvimento.
A técnica é relativamente simples, muito rápida e também adequada para amostras de tecido maiores. Achamos que nossa abordagem combinada com tomografia microcomputada de raios-X pode ser integrada ao fluxo de trabalho clínico e, em seguida, realmente ajudar os patologistas a tomar melhores decisões. Comece fixando as amostras de tecido mole.
Encha um tubo de centrífuga de 50 mililitros com uma solução fixa que contenha 9,5 mililitros de 4% de formaldeído e 0,5 mililitros de ácido acético glacial. Adicione a amostra de tecido mole ao tubo de centrífuga e leve à geladeira por 24 a 72 horas. Após a refrigeração lave a amostra de tecido mole com solução DPBS por uma hora.
Em seguida, colora a amostra colocando-a em dois mililitros da solução de coloração Eosin Y e incuba-la em uma placa de agitação horizontal por 24 horas. No dia seguinte, retire cuidadosamente a amostra de tecido mole do recipiente da amostra e remova o excesso de agente de coloração com papel de tecido de celulose. Coloque-o em um recipiente cônico acima de uma fase de vapor de etanol para armazenamento e uso posterior.
Prepare um suporte de amostra apropriado para montar a amostra de tecido mole de acordo com as instruções do manuscrito e garantir um ajuste apertado para evitar que a amostra se mova durante as medições da tomografia de raios-X. Uma vez que o adesivo tenha endurecido e o porta-amostras esteja pronto para usar, transfira o rim do rato para o tubo de centrífuga intacto que contém algumas gotas de 70% de etanol na parte inferior. Coloque a amostra montada no scanner de tomografia de raios-X.
Depois de alinhar cuidadosamente a amostra, escolha parâmetros de aquisição para a melhor qualidade de imagem. Para os dados de micro TC apresentados, adquira a varredura a uma tensão máxima de 50 quilovolts e uma corrente de 3,5 watts usando projeções de 1601 igualmente distribuídas ao longo de 360 graus. Em seguida, use os dados da micro TC da varredura de visão geral para selecionar a região de interesse para a tomografia computadorizada de alta resolução.
Prepare os volumes de interesse da amostra de tecido mole cortando-a em pedaços muito pequenos de aproximadamente 0,5 milímetros de comprimento de borda usando um bisturi e um microscópio estéreo. Se usar um rim de rato, corte-o em duas metades ao longo do eixo mais longo. Pegue metade e prepare diferentes regiões anatômicas, como córtex renal e medula renal.
Transfira as pequenas peças para uma nova placa de Petri para desidratação. Desidratar as amostras utilizando uma série de soluções de etanol de acordo com as instruções do manuscrito, realizando cada etapa de desidratação por uma hora. Transfira as amostras desidratadas para a cápsula microporosa e feche-as.
Mantenha as amostras em contato com 100% de etanol o tempo todo. Em seguida, ponto crítico seque os pequenos pedaços de tecido. Uma vez que as amostras de tecido são preparadas, mantenha-as em uma nova placa de Petri armazenada em um desiccador antes de uso posterior.
Monte as peças de tecido em um suporte de amostra apropriado, garantindo um ajuste apertado. Para um rim de rato, supercola as peças em um suporte de amostra usando um microscópio estéreo. Após um alinhamento cuidadoso da amostra, escolha parâmetros de aquisição para a melhor qualidade de imagem.
Para os dados nano-CT apresentados, adquira projeções em uma tensão máxima de 60 quilovolts com projeções de 1599 igualmente distribuídas ao longo de 360 graus e um tamanho voxel de aproximadamente 400 nanômetros. Este protocolo foi utilizado para visualização 3D de estruturas de tecido microscópico de um rim de rato. As medições de microCs de baixa resolução permitiram uma visão geral de todo o órgão e ajudaram a identificar volumes de interesse para medições de alta resolução.
O mesmo rim de rato foi usado para obter um microCs de alta resolução. Uma visão mais detalhada das estruturas anatômicas como o córtex, a medula externa e a medula interna, entre outras, é alcançada. Um volume de renderização de interesse mostra a região da medula e uma seção virtual através da embarcação.
A nano-TC foi utilizada para obter uma visão detalhada da amostra de rim em nível celular. Um pequeno pedaço de tecido obtido de todo o rim do rato foi usado para imaginar os membros ascendentes espessos do laço de Henle com um tamanho de voxel de cerca de 400 nanômetros. Foi realizado um estudo comparativo para garantir que o nano-TC seja totalmente compatível com a histopatologia.
A abordagem de imagem multimodal confirmou os resultados obtidos com ambos os métodos. Durante a etapa de incubação é crucial que a amostra esteja totalmente cercada pela solução de coloração. Também ao realizar imagens de raios-X ct, o fato mais importante é garantir a estabilidade da amostra durante a aquisição de dados.
As amostras de tecido mole que foram analisadas com nosso protocolo podem ser ainda mais analisadas usando técnica histológica padrão, como a hematoxilina contra-recontestável. Nosso protocolo de coloração contribuirá substancialmente para o avanço da histologia de raios-X 3D. A pesquisa médica se beneficiará especialmente dessa técnica de imagem 3D não destrutiva.
