O objetivo geral deste estudo é obter uma imagem 2D de tempo de atividade fagocítica em Células de Carcinomas M1 Macrófagos 4T1 Mouse em Co-culturas. O modelo de co-culturas das células de vida foi estabelecido e observado utilizando uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. A avaliação da atividade de fagocitose por macrófagos foi de imagem;usando software de imagem para dobrar o vídeo de lapso de tempo de vários pontos, antes de aestar nossa incubação.
A matéria que conduzimos prestes a atender às necessidades e benefícios do aprimoramento no comportamento dos macrófagos e sua atividade fagocítica com células cancerígenas. Especificamente no estudo está o carcinoma mamário do rato. A primeira parte deste estudo começa com células vivas modelo de co-cultura de células carcinomas mamárias de camundongos 4T1 e macrófagos de camundongos RAW 2647.
Comece o experimento criando 41 células de carcinomas mamários de camundongos e macrófagos de camundongos RAW 2647. Primeiro, descongele um frasco de células 4T1 e RAW 2647. Dilui as células descongeladas em 10 milímetros em um tubo cônico de 15 mil.
Em seguida, centrifugar as células a 660 g força por 5 minutos para obter pelota celular. Aspirar cuidadosamente a mídia, suspender as células em 8 milhões de mídia completa e transferir as células para o frasco da cultura tecidual. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Após uma semana de cultivo em condições de adesão, monitore o frasco diariamente e complemente com mídia completa atmil conforme necessário. O próximo passo continua com a imunossuagem de macrófagos RAW 2647 polarizados M1. Este passo é garantir uma polarização completa dos macrófagos M1.
Como a confluência do RAW 2647 atingiu 70 a 80% descartar a mídia cultural e enxaguar suavemente duas vezes com PBS. Prepare os macrófagos para coletas suavemente desalojando as células aderentes usando um raspador de células e transfira para um tubo cônico de 50 moinhos. Conte as células usando hemótmetro e prepare uma célula suspensa a uma densidade de 100.000 células por prato adicionando a solução restante à densidade sentada.
Sente-se 2 milhões de suspensão de macrófagos em dois pratos de imagem. Incubar as células de 2 a 3 horas a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono para permitir a adesão celular. Prepare a mídia de polarização M1 adicionando 100 nilligram por moinho LPS e 20 nilligram por moinho interferon-gama em um meio completo complementado com 10% de FBS.
Descarte as culturas supernasas dos macrófagos incubados antes e lave cuidadosamente as monocamadas no prato duas vezes usando PBS. Adicione 2 milhões de mídia de polarização M1 em um dos pratos correspondentes e permita que as células dura infundissem em macrófagos M1. Antes de imunostainar, fixe as células de macrófagos RAW e M1 usando 2 milhões de paraformaldeído de 4% e incubar por 50 minutos em temperatura ambiente.
Remova o supernatante e lave a monocamada das células usando PBS, pelo menos três vezes. Sacie com 2 milhões de cloreto de amônio de 50 milímetros em PBS e incubar por 50 minutos em temperatura ambiente. Permeabilize usando 0,3% Triton X-100 em PBS por 50 minutos em temperatura ambiente.
Etapa de bloqueio usando 10% de FBS por 30 minutos em temperatura ambiente pbs. Incubar com anticorpo anti-iNOS conjugado FITC na PBS e 1% FBS durante a noite a 4 graus Celsius. Incubar 1 moinho de DAPI em pratos de imagem por 10 minutos a 37 graus Celsius em condição escura, cobrindo com papel alumínio.
Lave as células usando PBS pelo menos 3 vezes e adicione 1 milhão de DMEM em pratos correspondentes e pronto para imagens fluorescentes. O próximo passo prossegue com a semeadura de células carcinomas mamárias de camundongos 4T1. Como a confluência de células 4T1 atingem 70 a 80% descartam a mídia cultural e enxaguam suavemente duas vezes com PBS.
Adicione 1 milhão de trippsina pré-aquecida para desociar as células e incubar por até 20 minutos a 37 graus Celsius. Uma vez que as células pareçam descontribuídas, transfira as células descontribuídas para um tubo cônico de 15 milhões. E adicione 2 milhões de meio completo pré-aquecido para inativar o tubo visto.
Centrífuga a 600 g força por 5 minutos para obter uma pelota celular. Remova a pelota supernasce e suspenda-se de re-suspensão em 10 mil de amostragem pré-corrida do meio DMEM. Conte as células usando hemótmetro e sementes 100.000 células em DMEM moinho.
Em imagens com TC tratados. O próximo passo é rotular células de carcinomas mamários de camundongos vivos 4T1 usando coloração CFSE. Primeiro, remova a mídia existente do prato de imagem que anteriormente semeado com células 4T1.
Prepare a solução de coloração CFSE diluindo a coloração DE CFSE em 1 usina de PBS para fazer 5 macrmal fora trabalhando consentido. Adicione 1 milhão de solução de coloração CFSE em prato de imagem para incubar células por 20 minutos à temperatura ambiente ou 37 graus Celsius no escuro. Adicione um DMEM igual às células mais a solução de coloração e deixe a semente por 5 minutos.
O próximo passo é semear macrófagos de camundongos RAW2647 e co-cultura com 4T1. Após o nivelamento CFSE de células 4T1, lave o prato de imagem duas vezes, usando PBS. Semente 2 moinho de suspensão de macrófagos em prato de imagem 4T1.
O próximo passo é polarizar os macrófagos RAW 4627 no finnatipo M1. Adicione 2 milhões de mídia de polarização M1 no prato de imaginar e permita que as células RAW infundam no macrófago M1 finnatype. A segunda parte do estudo é a avaliação de lapso de tempo das células 4T1 de macrófagos M1.
O próximo passo inclui a avaliação da fagocitose de microscopia de vídeo ao vivo. Primeiro, ligue o microscópio. Configurar a temperatura a 37 graus Celsius.
E 5% de gás carbônico. Posicione as células de co-cultura no centro do palco e aparafuse suavemente na câmara superior. Use o joystick para motorizar o palco selecionando diferentes posições a serem capturadas.
Há muitos fatores que precisam ser considerados durante a realização de imagens de células vivas. Para obter um vídeo bem pequeno. Requer otimização da exposição por imagem, medição de tempo e também automatização da correção do foco.
Caso o vídeo esteja mais exposto, o intervalo de tempo incorreto e também fora de foco, custará que o vídeo fique inutilizável. A repetição do experimento precisa ser feita se um desses fatores for detectado. A figura um mostra imunofluorescências girando com anti-iNOS em verde.
Marcador nuclear DAPI em azul. E versões aprimoradas da maioria das imagens. Movie 1 é um filme representativo de células vivas de compreensão de macrófagos M1 e 4T1.
CFSE manchou a maioria das co-culturas de carcinomas mamários capturadas usando aquisição multicanal de florescent e microscopia ic. Filme 2 vídeo live-cell microscopia filmes de vários pontos em um único prato conjugal. Mostrando fagocitose de 4T1 por macrófagos M1 induzidos.
As imagens foram capturadas em intervalos de 50 minutos durante 13 horas. Filme 3 filme de microscopia de vídeo ao vivo, de um único ponto de coordenada escolhido para mostrar uma visualização aprofundada da fagocitose de 4T1 por Macrófagos M1. Setas vermelhas mostram aos macrófagos M1, o círculo amarelo mostra que um número de células 4T1 saciam fluoreno e goffman de células 4T1.
Os macrófagos M1 descrevem como porocistplasma como carcinomas de memória de camundongos 4T1 têm uma morfologia epitélio. Macrófagos podem ser vistos se movendo para adicionar células 4T1 para estabelecer contato celular-célula. Que é então seguido pela absorção de células 4T1 por macrófagos M1.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão sobre como realizar experimentos de microscopia de vídeo ao vivo;com carcinoma mamário de rato 4T1 e macrófagos RAW 2647 merad. Você também deve configurar ao longo da noite co-culturas de ambos os tipos de células para realizar o ensaio de fagocitose. Você também deve entender como os co-cultuers de 4T1 com LPS e macrófagos interferon-gama.
