Este protocolo é significativo porque permite a geração de organoides testículos, que podem ser usados como plataforma para estudar morotegênese testículo e para exames de alta droga de tropo e toxicidade. A principal vantagem desta técnica é que ela é altamente reprodutível, requer um número relativamente baixo de células e pode ser usada para gerar um grande número de organoides testiculares com arquitetura específica de testis. Esse método pode ser aplicado para estudar outros sistemas, como células-tronco pluripotentes ou células de ilhotas pancreáticas com as otimizações necessárias.
Demonstrando o procedimento de digestão enzimática do tecido testicular será Anna Voigt, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Colete o testío em um béquer estéril e lave com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%. Após a lavagem, transfira o testímetro para um prato de cultura de tecido de 100 milímetros com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%.
Use tesouras autoclavadas e fórceps para remover a tunica vaginalis e epidídicos. Transfira o testímetro isolado para um novo prato de 100 milímetros e lave bem com PBS contendo estreptomicina de penicilina de 1%. Corte o testis ao longo do eixo longitudinal diretamente sob a tunica.
Em seguida, retire o testé da tunica usando dois fórceps e coloque-o em um novo prato de 100 milímetros contendo 1 mililitro de DMEM com estreptomicina de penicilina de 1%. Pique o testímetro descascado com uma tesoura estéril em pedaços de tecido de um a dois milímetros. Depois de cortar use fórceps estéreis para remover os fragmentos brancos do tecido conjuntivo.
Transfira os pedaços de tecido picado para a solução A em um tubo de 50 mililitros e cubra-os até 50 mililitros com DMEM para obter uma concentração de 0,4 miligramas por mililitro para colagenase 4S e uma concentração de 0,8 miligramas por mililitro para colagenase 4W. Coloque o tubo contendo os pedaços de tecido em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos. Inverta suavemente o tubo a cada cinco minutos.
Após 30 minutos, centrifugar o tubo a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Descarte o supernasce, ad 40 mililitros da solução B, e cubra até 50 mililitros com DMEM para obter uma concentração de 1,2 miligramas por mililitro de colagenase 4W. Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius por 30 minutos e inverta suavemente o tubo a cada cinco minutos.
Centrifugar o tubo a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Depois disso descarte o supernasciante, e lave uma vez com PBS com estreptomicina de penicilina de 1%. Colecione cuidadosamente os túbulos de cima e coloque em um novo tubo de 50 mililitros.
Cubra o tubo com PBS até 50 mililitros. Centrifugar os túbulos a 90 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por 1,5 minutos. Descarte o supernatante e adicione PBS fresco para lavar duas vezes adicionais.
Após a última lavagem pbs remova o supernasciente e suspenda-os derretro os túbulos seminiferos em cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicione 15 mililitros de 0,25% Trypsin EDTA aos túbulos. Coloque o tubo em um banho de água de 37 graus Celsius e inverta suavemente a cada dois minutos.
Após cinco minutos avalie a digestão enzimática dos túbulos para células únicas sob o microscópio com 10 microlitros de amostra em uma placa de cultura tecidual. A cada dois minutos coloque a amostra sob o microscópio para observar. Se a maioria das células únicas pode ser detectada parar a reação com cinco mililitros de FBS e filtrar através de uma malha de 70 mícrons e, em seguida, através de uma malha de 40 mícrons.
Centrifugar as células únicas a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Suspenda-se em 50 mililitros de meio de enriquecimento, e conte o número de células viáveis usando um hemótmetro. Transfira 20 milhões dessa população celular inicial para cada uma das duas placas de Petri de apego ultra-baixa de 100 milímetros e incuba em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 21% de oxigênio por dois dias.
Cede 20 a 25 milhões de células da população de células iniciais restantes por prato de cultura tecidual de 100 milímetros em um volume total de oito mililitros de meio de enriquecimento. Coloque o prato em uma incubadora e depois de 1,5 horas certifique-se de que a maioria das células Sertoli estão presas à placa. Incline ligeiramente duas placas para coletar e combinar os supernantes em uma nova placa de 100 milímetros e colocá-la de volta na incubadora.
Depois de uma hora, novamente combine os supernacantes de duas placas a uma nova placa de 100 milímetros. Coloque as placas de volta na incubadora durante a noite. Em seguida, colete as células germinativas enriquecidas em duas frações, fração não aderente e fração ligeiramente aderente.
Colete o supernatante como a fração não aderente. Para a fração ligeiramente aderente lave as placas suavemente com PBS e trate com dois mililitros de uma diluição de 0,25% Trypsin EDTA por cinco minutos à temperatura ambiente. Pare a reação adicionando dois mililitros de meio de enriquecimento e colete no tubo de fração não aderente.
Combine a preparação das células iniciais e as células germinativas enriquecidas em um tubo para obter uma preparação celular de trabalho contendo células germinativas de 25%. Centrífuga a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Descarte o supernasce e suspenda as células em 20 mililitros de meio de formação organoide para atingir uma concentração de 2,4 milhões de células por mililitro.
Em um novo tubo adicione um mililitro da solução que contém células. Adicione 0,5 mililitros de solução de lavagem de surfactante para cada poço em uma placa de micro poço. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar está presa no poço.
Para remover bolhas de ar centrifugar a placa a 2.000 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por dois minutos. Observe a placa sob um microscópio invertido de baixa ampliação para verificar se as bolhas foram removidas dos micro poços. Cubra a placa com uma tampa e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente.
Após o tratamento ser concluído, remova a solução de lavagem e lave imediatamente a placa com água estéril ou PBS. Adicione 0,5 mililitros de formação organoides médios a cada poço e centrífuga a 2.000 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por dois minutos para remover quaisquer bolhas de ar presas. Observe o poço sob um microscópio invertido de baixa ampliação para verificar se as bolhas de ar foram removidas.
Adicione 0,5 mililitros da suspensão da célula de trabalho e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Centrífuga a 500 vezes G com quebras a 25 graus Celsius por cinco minutos. Use um microscópio invertido para verificar se as células se aglomeraram dentro dos micro poços.
Transfira a placa para uma incubadora de cultura celular e cultura por cinco dias. Troque metade do meio dia não. Para recuperar os organoides use uma pipeta de boca larga para gentilmente pipetizar o meio para cima e para baixo.
Isso permite que os organoides saiam dos micro poços. Colete os organoides, corrija e realize a citoquímica imuno para marcador de células germinativas, marcador celular sertoli, marcador celular myóide peritubular e marcador celular Leydig e visualize sob um microscópio confocal. Neste estudo, células isoladas de testículas porcinas de uma semana de idade que foram cultivadas em micro poços auto-organizados em esferoides com compartimentos exteriores e interiores delineados e distintos.
Os dois compartimentos foram separados por uma membrana de porão positiva de colágeno IV. GATA4 células sertoli positivas e células germinativas positivas UCHL1 estavam no compartimento externo na membrana do porão. as células myóides peri-tubulares positivas da ASMA foram localizadas ao longo do interior da membrana do porão, enquanto as células leydig positivas CYP450 estavam no centro do interstício.
Esta estrutura é semelhante às condições in situ, onde as células leydig, células myóides peri-tubulares, estão localizadas no interstício, no compartimento intersticial e células germinativas, as células sertoli estão localizadas no epitélio seminifero. É importante garantir que as células que estão sendo usadas para gerar organoides tenham a melhor qualidade. Deve-se prestar atenção cuidadosa durante a fase de experimentação da digestão enzimática.
Após este procedimento, os organoides podem ser cultivados a longo prazo para estudar a diferenciação de células germinativas ou analisar para expressão genética e proteínas ou hormônios secretos. A capacidade de criar organoides com associações celulares específicas de testis fornece um novo sistema in vitro para estudar interações célula-células importantes para o desenvolvimento de testis e função de células germinativas.
